Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
6.11. РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА
Денатурацию белка в определенных условиях in vitro удается обратить, перейдя от развернутой полипептидной цепи к компактной глобуле, имеющей вполне определенную пространственную структуру. Этот процесс, называемый ренатурацией, моделирует, хотя и не в полной мере, свертывание полипептидной цепи в глобулу в ходе трансляции при биосинтезе белка
Как известно, пространственная структура белка определяется его первичной структурой. Известное соотношение один ген — один белок в сущности эквивалентно утверждению, что генетически детерминированной последовательности аминокислот достаточно для того, чтобы однозначно предопределить ее свертывание в свойственную тому или иному белку третичную структуру. Разумеется, в общем случае такое заключение справедливо лишь для условий, близких к существующим в данной клетке при биосинтезе данного белка, которые могут включать в себя определенный диапазон pH, присутствие некоторые ионов, Например ионов кальция, а также кофакторов, присущих этому белку, Например коферментов, гема и т.п.
При соблюдении указанных условий будет достигнуто рассмотренное выше соотношение факторов, от которого зависит стабильность белковой глобулы, т.е. создадутся термодинамические предпосылки формирования нативной структуры — ренатурации белка.
Это положение было подтверждено успешными опытами по ренатурации белков in vitro, проведенными впервые К.Анфинсеном и сотрудниками в 60-х годах, на панкреатической рибонуклеазе и лизо-циме, а затем и на ряде других объектов.
Многие белки, в том числе обладающие внутримолекулярными дисульфидными связями, полностью денатурируют в присутствии высоких концентраций . мочевины или солянокислого гуанидина с одновременным расщеплением дисульфидных связей восстанавливающими агентами (меркаптоэтанолом меркаптоуксусной кислотой или
132
дитиоэритритом). Это, естественно, сопровождается их полной инактивацией.
При медленном удалении денатурирующего агента и восстановителя (например, диализом или гель-фильтрацией) происходят формирование нативной структуры, замыкание дисульфидных связей (для чго часто достаточно окисления кислородом воздуха) и полное восстановление активности белка. В специальных опытах была подтверждена правильность образования дисульфидных связей, что свидетельствует, в дополнение к реактивации, о восстановлении нативной структуры. На примере одного из белков — лизоцима — этот вывод был прямо подтвержден методом рентгеноструктурного анализа. Табл. 6.4 иллюстрирует эффективность ренатурации ряда белков.
Таблица 6.4. Ренатурацяя белков, денатурированных обработкой 8 М мочевиной или 6 М солянокислым гуанидином с одновременным восстановлением дисульфидных связей
Белок Молекуляр Число S-S Выход, %
теорети достиг
ческий* нутый
Рибо'нуклеаза 18 ООО 4 1 95
Лизоцим 12 ООО 4 1 50-80
Такаамилаза* * 40 ООО 4 + SH 0,3 48
Трипсиноген 25 ООО 4 1 60 '
Пепсиноген 38 ООО 3 6,7 50
Сывороточный альбумин 66 ООО ¦ 17 --- 50
"Теоретический выход рассчитан в предположении, что дисульфидные связи образуются случайно.
** о-Амилаза Aspergi Нus oryzae.
Может показаться, что вывод о предопределенности пространственной структуры последовательностью аминокислот, подтверждаемый указанными выше опытами, не вполне строг. Дело в том, что экспериментальное доказательство полноты разрушения всех нековалентных взаимодействий при денатурации белка затруднено, поэтому нельзя исключить сохранения какой-то части ядра нативной структуры. Этот довод опровергается, однако, тем, что целый ряд (правда, небольших) белков удалось получить химическим синтезом их полипептидных цепей из производных аминокислот. Такие пептидные цепи неизменно
133
давали при ренатурации хороший выход активного (и, значит, нативного) белка (см. гл. 2).
Несмотря на успешное образование нативной структуры, ренатура-ция белков in vitro протекает весьма медленно, что не соответствует высокой скорости свертывания третичной структуры в физиологических условиях. По-видимому, наиболее существенна трудность выбора оптимального, кинетически выгодного пути перехода от развернутой полипептидной цепи к компактной пространственной структуре. Число всех возможных способов свертывания достаточно длинной полипептидной цепи настолько велико (среди них окажется множество непродуктивных, тупиковых), что переход к правильной структуре простым перебором различных конформаций потребовал бы огромного времени.
Реальное свертывание белка, очевидно, происходит по одному, во всяком случае немногим путям, что резко сокращает время формирования нативной структуры. Свертывание полипептидной цепи in vivo по необходимости синхронизировано с ее биосинтезом, что уже открывает возможность выбора определенного пути, так как формирование пространственной структуры может происходить котрансляционно. Более того, при свертывании белка в физиологических условиях может быть существенной та конформация, в которой полипептидная цепь покидает пептидилтрансферазный центр рибосомы, и даже темп образования цепи — есть данные о задержках трансляции на участках цепи, являющихся границами между элементами вторичной структуры.
