Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Максимально достижимое значение освобождения радиоактивности, измеряемое путем обработки клеток-мишеней кроличьей антисывороткой к лимфоцитам лягушки и комплементом или сапонином, варьирует от 60 до 95% (в среднем 90%).
VIII. ПОЛУЧЕНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ СЛИЯНИЕМ ЛИМФОЦИТОВ Xenopus С КЛЕТКАМИ МИЕЛОМЫ МЫШЕИ
Слияние спленоцитов Xenopus (5-107 клеток, приготовленных, как описано в разд. IV, Б) с клетками миеломы мышей BALB/c производят с помощью ПЭГ 6000. Мы использовали резистентные к азагуанину линии РЗ XG3 BALB/c Ag8 и Sp20 (Kohler, 1979; Shulman et al., 1978). После слияния клетки инкубируют в панелях для микротитрования в условиях культивирования клеток мыши (осмолярность среды, оптимальная
Изучение иммунной системы Xenopus
507
для клеток мыши, 37 °С) в присутствии гипоксантина, аминоптерина и тимидина (ГАТ-среда) с добавлением в среду 10% СПК. В каждой из лунок (объем лунки 0,2 мл) содержится примерно МО5 клеток (лимфоциты-)-миеломные клетки, а также 0,5* 104 клеток перитонеального эксудата мышей BALB/c). В культуры клеток два раза в неделю добавляют питательные вещества. Клетки необходимо культивировать в течение более длительного периода (до 4 нед), чем при слиянии клеток одного вида, так как некоторые гибридные (лягушка — мышь) клоны появляются очень поздно (через 3 нед после слияния). При использовании рекомендованных выше количеств клеток в среднем получают 1—2 жизнеспособных и стабильных клона гибридных клеток. Хромосомный анализ гибридных клеток относительно прост. Все хромосомы Xenopus субметадентрические и телоцентрические, тогда как хромосомы мыши акроцентриче-ские, за исключением одной, которая специфична для линии клеток Х63 и имеет метацентрическую организацию (робертсоновская транслокация). Акроцентрические хромосомы мыши выявляют с помощью С-окрашивания. При этом центромеры хромосом Xenopus не окрашиваются (Hengartner, Du Pasquier, 1981).
Гибридные клетки в качестве эксперимента можно проанализировать на содержание антигенов Xenopus так же, как и любые другие клетки Xenopus (разд. VI, Б).
IX. МАРКЕРЫ КЛЕТОК; ПЛОИДНОСТЬ КАК МАРКЕРНЫЙ ПРИЗНАК
Очень часто, особенно при использовании химер, необходимо знать, какими частями химерного организма продуцируются те или иные клетки. Для этого нужны маркеры клеток.
В случае химер X. borealisXX. laevis описан хороший ядер-ный маркер (Thiebaud, 1983). Однако, когда для частей химерного организма необходима совместимость по МНС, такие маркеры применять нельзя. В этих ситуациях лучшим маркером остается плоидность клеток.
А. Получение полиплоидных Xenopus
Поскольку в настоящее время имеются линии Xenopus, стало возможным получение генетически идентичных по локусу МНС животных, различающихся только плоидностью. У самок линий f, g, г, j стимулируют созревание яиц и оплодотворяют их in vivo спермой самцов той же линии. Через пять минут
508 Глава 25
после оплодотворения яйца подвергают в течение 5 мин гидростатическому шоку при давлении 400 атм (Dasgupta, 1962), что препятствует последнему мейотическому делению. В результате получается триплоидное потомство. При аналогичном манипулировании с самками-гибридами X. laevisXX. gilli (LG-гибриды) с использованием облученной спермы аутбредных самцов получают тетраплоидных изогенных животных, поскольку яйца LG-гибридов исходно диплоидные.
Б. Способы определения плоидности клеток у химер
При работе с гемопоэтическими клетками плоидность эритроцитов или лимфоцитов легко определить одним из следующих методов.
1. Применение клеточного сортера
Определение плоидности с помощью окрашивания ДНК недавно описали Флайник и др. (Flajnik et al., 1984а).
2. Подсчет ядрышек
Этот метод особенно удобен при изучении эритроцитов. На свежеприготовленных мазках крови хорошие результаты дает следующая методика (Olert, 1979). Смешивают 7 частей свежеприготовленного раствора AgNOe (50%-ный раствор в воде, вес/объем) с одной частью муравьиной кислоты (0,2%-ный раствор, забуференный формиатом натрия, pH 2,9). Через 10 мин каплю смеси помещают на мазок и накрывают покровным стеклом. Окраска развивается через 3 мин. Сначала ядрышки имеют оранжевый цвет, но со временем они становятся почти черными. Наибольшее число ядрышек на клетку, обнаруживаемое в препарате, соответствует плоидности организма (например, три ядрышка = триплоид).
3. Определение числа хромосом
Этот метод удобен в тех случаях, когда нужно определить плоидность, не забивая или не оперируя животное. Его применяют для оценки пролиферативной способности трансплантированных лейкоцитов. Он включает стимуляцию лейкоцитов крови in vitro митогеном и последующее приготовление хромосомных препаратов на третий или четвертый день после стимуляции.
Изучение иммунной системы Xenopus
509
Лейкоциты готовят, как описано в разд. IV, стимулируют ФГА-Р (Difco) в разведении 1:16000—1:48 000 и на третий день собирают клетки.
После промывки в ЗФР клетки подвергают гипотоническому шоку, обрабатывая их 2 мл 0,05 М КС1 в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем проводят предварительную фиксацию клеток, добавляя к ним 2 мл свежего фиксирующего раствора (3 части метанола +1 часть уксусной кислоты), что необходимо для предотвращения агглютинации набухших клеток.
