Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
II. ОПИСАНИЕ КЛЕТОЧНОГО СОРТЕРА
Набор оборудования, входящего в комплект клеточного сор-тера, варьирует от прибора к прибору. Мы работаем в основном на приборе FACS II (Becton Dickinson, США), снабженном компьютером, и эта глава написана с учетом именно этого прибора. Вместе с тем представленная в главе информация будет полезна всем, кто работает на подобных приборах, независимо от конкретного типа клеточного сортера.
На рис. 20-1 показана схема флуоресцентного клеточного сортера, который устроен примерно так же, как FACS II. В приборе можно выделить три основных блока: 1) оптическую
скамью, где производят измерения (и разделение); 2) блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и обрабатываются, принимаются решения об отнесении клетки к той или иной популяции при сортинге и сигналы переводятся в цифровую форму; 3) блок сбора и обработки данных (например, компьютер).
А. Оптическая скамья
Оптическая скамья предназначена для измерения рассеяния света и флуоресценции; здесь же происходит механический процесс разделения клеток. Клетки вводят в поток жидкости, ширина которого составляет 50—100 мкм на выходе из наконечника форсунки. На струе сфокусирован лазер. В тот момент, когда клетки проходят через луч лазера, они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции.
1. Переднее рассеяние света (ПРС)
Переднее рассеяние света (количество света, рассеиваемое в направлении лазерного пучка) может быть обусловлено многими параметрами исследуемого объекта (размером, формой,
328 Глава 20
Сигнал о приобретении каплей заряда
Рис. 20-1. Схема снабженного компьютером флуоресцентного клеточного сор-тера, аналогичного по конструкции прибору FACS II.
коэффициентом преломления, структурой), и поэтому ПРС не может дать прямой информации о каком-либо одном конкретном свойстве. Например, если одна клетка характеризуется в два раза большим рассеянием, чем другая, без дополнительной информации мы ничего не можем сказать об их относительных размерах, форме и т. д. Тем не менее для проточной цитометрии ПРС является очень полезным показателем, на основе которого без привлечения дополнительных данных можно отличать жизнеспособные лимфоциты от мертвых лимфоцитов и эритроцитов. Кроме того, с определенными допущениями различия в светорассеянии лимфоцитов можно соотнести с различиями в их размерах.
ПРС можно описать семейством параметров. Детектор, измеряющий интенсивность рассеиваемого света, имеет круглую форму и размещается так, что через его центр проходит пучок лазера, а поток жидкости располагается между лазером и детектором. Результаты эксперимента в значительной степени зависят от угла, под которым измеряют ПРС. При малых углах
Методы сортировки клеток в иммунологии
329
(так называемое малоугловое рассеяние) ПРС более чувствительно к размерам частиц, чем при больших, где важное значение приобретает коэффициент преломления.
2. Перпендикулярное (или боковое) рассеяние света
Как следует из заголовка, речь идет об измерении интенсивности света, рассеянного по отношению к лазерному пучку под углом 90°, а не 0° (как для ПРС). Как и в случае ПРС, для бокового рассеяния можно установить соотношения между различными свойствами клеток (например, размером и коэффициентом преломления) и интенсивностью рассеиваемого света. К сожалению, эти соотношения сложны и даже не всегда строго пропорциональны соответствующим изменениям. Например, при постоянстве всех других параметров увеличение размера клеток не обязательно приводит к уменьшению или увеличению бокового рассеяния. Тем не менее данные бокового рассеяния полезны, так как они дают возможность различать субпопуляции клеток. Например, лимфоциты, моноциты и нейтрофилы существенно различаются по степени бокового рассеяния.
3. Флуоресценция
С помощью разделяющих пучок зеркал, а также дихроиче-ских и обычных зеркал в большинстве проточных цитометров удается измерять одновременно несколько флуоресцентных сигналов. Показания детектора зависят от свойств света, достигающего его (цвета или длины волны). Избираемый цвет в свою очередь обусловлен флуорохромом.
Б. Обработка сигналов
В блоке обработки поступающие от детектора сигналы усиливаются, сравниваются на основе Выбранных критериев и в зависимости от результатов сравнения производят одно из двух описанных ниже действий, оба эти действия сразу или не производят ни одного из них: 1) сигнал посылается на оптическую скамью и клетка отбирается; 2) зарегистрированные параметры для клетки посылаются в блок сбора данных. В большинстве проточных цитометров процессинг инициируется, когда сигнал светорассеяния превышает фон на определенное пороговое значение. Поскольку клетки большинства типов дают интенсивный сигнал светорассеяния, включение процессинга по светорассеянию обеспечивает регистрацию данных для всех жизнеспособных клеток. Это важно для оценки доли позитивно или негативно окрашенных клеток в популяции.
330 Глава 20
После усиления сигналы, полученные от клетки, сравнивают с заданными параметрами, чтобы определить, является ли регистрируемое событие тем, которое нас интересует. Процесс, с помощью которого мы отбираем интересующее нас событие, называют дискриминацией, а ограничения, накладываемые на регистрируемый параметр,— окнами. Правильный выбор параметров дискриминации или окон является критическим для адекватного использования клеточного сортера (разд. VI,А). Включение определенных субпопуляций в анализ и исключение их из него могут существенно влиять на результаты.
