Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Методы сортировки клеток в иммунологии
335
ме того, присутствие агрегатов создает дополнительные трудности при дискриминации небольших скоплений клеток и одиночных крупных клеток. Все это приводит к ошибкам в измерениях и подсчете. Наконец, при разделении недиспергированных клеток позитивные по флуоресценции клетки могут быть в значительной степени загрязнены негативными клетками. Первым шагом в получении суспензий одиночных клеток является хорошее измельчение исходного материала, не приводящее, однако, к гибели клеток.
Метод 1
Этот метод с незначительными вариациями применим для работы со многими тканями (селезенки, лимфатических узлов, тимуса, костного мозга).
1. Соответствующий орган удаляют и помещают в чашку Петри со средой или «буфером для сортировки» (СР+ +0,1% NaN3+l% БСА). В случае селезенки и костного мозга соответствующий орган разрезают на две половины и одну из них осторожно переносят в чашку Петри. Клетки вымывают средой, выпускаемой через иглу из шприца. Нужно следить за тем, чтобы при набирании и выпускании жидкости в иглу не попадали клетки. Другие ткани осторожно измельчают пинцетом.
2. Клеточную суспензию переносят в пробирку и дают ей отстояться 5—10 мин, для того чтобы осели комки клеток и крупные остатки тканей. Затем суспензию переносят пипеткой в другую пробирку, стараясь при этом не захватывать осевший агрегированный материал.
3. Клетки дважды промывают буфером для сортировки и ресуспендируют при концентрации 5-107 клеток/мл.
Метод 2 (Джона Мак-Керна)
1. Измельчают ткань в объеме примерно 5 мл СР с добавлением глюкозы (СР-глюкозы).
2. Несколько раз пропускают полученную суспензию через пипетку, для того чтобы диспергировать клеточные комки.
3. Пропускают клеточную суспензию через иглу № 19 или 20.
4. В кончик пастеровской пипетки вносят небольшой, неплотно свернутый кусочек ваты и суспензию пропускают через вату для удаления агрегатов и мертвых клеток. Эту процедуру можно повторять по мере необходимости на любом этапе приготовления образцов для сортинга.
5. Клетки промывают в ЗФР с 0,25% БСА и 0,02 М NaN3.
336 Глава 20
Б. Окрашивание
Прямое окрашивание включает инкубацию клеток с флуоро-хром-конъюгированным реагентом, специфичным по отношению к исследуемому клеточному маркеру. Непрямое окрашивание предполагает два этапа. Сначала клетки обрабатывают реагентом, специфически взаимодействующим с выявляемым маркером клеточной поверхности, а потом добавляют конъюгированный с флуорохромом агент, специфически связывающийся с реагентом, использованным на первом этапе. Для обоих вариантов окрашивания основная процедура одна и та же. Клетки инкубируют с насыщающими концентрациями реагентов в течение 30 мин, а затем отмывают от несвязавшихся агентов. Для определения оптимального при окрашивании количества реагентов проводят предварительные эксперименты. В идеале следует использовать минимальные дозы реагентов, при которых наблюдается насыщение лиганда. При этом сводятся к минимуму эффект неспецифического окрашивания и ошибка в дозировке соответствующих реактивов. Некоторые реагенты, например агглютинин из проростков гороха или некоторые IgM-антитела, нужно использовать в более низких концентрациях, для того чтобы избежать агглютинации клеток.
1. Методы окрашивания
Метод 1
1. Пипеткой переносят ~106 клеток (50 мкл суспензии с концентрацией 5-107 клеток/мл) в полистирольные пробирки и добавляют установленное в предварительных экспериментах количество реагента.
2. Клетки перемешивают с реагентом и смесь инкубируют 30 мин при 4 СС.
3. Клетки дважды промывают охлажденным буфером для сортировки и ресуспендируют в 0,3 мл того же буфера.
4. Для непрямого окрашивания клеткам дают возможность осесть, осадок ресуспендируют в ~ 100 мкл буфера и добавляют второй реагент. После этого повторяют процедуры, описанные в пп. 2 и 3.
Метод 2
Этот метод особенно удобен при работе с небольшими количествами клеток. Окрашивание проводят в лунках панелей для микротитрования и, если сортер не имеет приспособлений для отбора проб из лунок, клетки в конце процедуры переносят в пробирки. Описание этого метода приведено в гл. 10.
Методы сортировки клеток в иммунологии
337
2. Окрашивание мертвых клеток
Если жизнеспособность клеток низкая, то имеет смысл пометить мертвые клетки, чтобы исключить их из анализа. С этой целью обычно используют иодистый пропидий (ИП) — препарат, окрашивающий ДНК. Применение этого препарата с реагентами, меченными ФИТЦ, приводит к тому, что мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а поверхность клеток — в зеленый.
Для окрашивания мертвых клеток конечная концентрация ИП в растворе должна составлять 20 мкг/мл. Поскольку интенсивность флуоресценции связанного ИП гораздо выше, чем свободного, можно не отмывать образцы от несвязавшегося ИП. При этом клетки, погибшие уже после приготовления препарата, также будут захватывать ИП. Однако некоторые исследователи все же предпочитают отмывать клетки от свободного ИП.
