Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Д. Адсорбция на пластике
Для адсорбции IgG в лунках 96-луночных микропанелей из поливинилхлорида (Dynatech) в каждую лунку вносят по 50 мкл раствора, содержащего 10 мкг/мл IgG в ЗФР, и инкубируют в течение ночи при 4 °С во влажной камере. Несколько контрольных лунок не должны содержать белка. После адсорбции раствор из лунок отсасывают и лунки трижды промывают 100—150 мкл ЗФР — 0,1%-ным БСА. Для насыщения белоксвя-зывающих сайтов пластика панели погружают в ЗФР—1%-ный БСА по крайней мере на 20 мин.
Е. Инкубация проб
Пробы культуральной надосадочной жидкости, разбавленные средой, или пробы сыворотки, разбавленные раствором, в состав которого входят ЗФР, 1%-ный БСА, 0,02%-ный азид натрия, вносят в лунки и инкубируют в течение ночи при 4 °С. После инкубации содержимое лунок отсасывают и лунки промывают 2—3 раза 100—150 мкл ЗФР — 0,1%-ным БСА. Рекомендуется использовать пробы надосадочной жидкости культур, разбавленные в 1—100 раз, и пробы сыворотки, разбавленные в 100—10000 раз.
Ж. Инкубация с мечеными антителами к ц-цепям
В каждую лунку вносят 50 мкл 1251-антител к ц-цепям, разбавленных раствором, в состав которого входят ЗФР, 1%-ный БСА, 0,02%-ный азид натрия, так чтобы в этом объеме содержалось приблизительно 10 нг или 10000—50000 имп/мин. Инкубируют при комнатной температуре 4—8 ч. Отсасывают содержимое лунок, дважды промывают лунки 100—150 мкл ЗФР и 10 раз водопроводной водой. Панели переворачивают вверх дном и высушивают на фильтровальной бумаге. Каждую лунку вырезают ножницами и измеряют связанную радиоактивность в гамма-счетчике.
Клетки, синтезирующие ревматоидный фактор
325
Литература
Carson D. A., Lawrance S., Catalano М. A., Vaughan J. Н„ Abraham G. (1977). J. Immunol., 119, 295.
Catt K., Tregear G. W. (1967). Science, 158, 1570.
Cunnigham A. //., Szenberg A. (1968). Immunology, 14, 599.
Dresser D, W. (1978). Nature (London), 274, 480.
Gronowicz E., Coutinho A., Melchers F. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 588.
Hunter R. (1970). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 133, 989.
Jerne N. K.. Nordin A. A. (1963). Science, 140, 405.
Klinman N. R., Pickard A. R., Sigal N. H., Gearhart P. J., Metcalf E. S., Pierce S. K. (1976). Ann. Immunol, (inst. Pasteur), 127C, 489.
March S. C., Parikh I., Cuatrecasas P. (1974). Anal. Biochem., 60, 149.
Mishell R. I., Dutton R. W. (1967). J. Exp. Med., 126, 423.
Nemazee D. A., Sato V. L. (1983). J. Exp. Med., 158, 529.
Rose H. М., Ragan C., Pierce E., Lipman M. O. (1948). Proc. Soc. Exp. BioL Med., 68, 1.
Tanimoto K-, Cooper N. R., Johnson J. S., Vaughan J. H. (1975). J. Clin. Invest., 55, 437.
Taylor-Upsahl М. М., Abrahamsen R. М., Natvig J. B. (1977). Clin. Exp. Immunol., 28, 197.
Vaughan J. H., Chihara Т., Moore T. L., Robbins D. L., Tanimoto K., Johnson J. S., McMillan R. (1976). J. Clin. Invest., 58, 933.
Waaler E. (1940). Acta Pathol. Microbiol. Scand., 17, 172.
Zvaifler N. J., Schur P. M. (1968). Arthritis Rheum., 11, 523.
Глава 20
Методы проточной цитофлуориметрии и сортировки клеток в иммунологии
Уильям Лейзерсон
1. ВВЕДЕНИЕ
Функционирование иммунной системы обеспечивается клетками многих типов. Совершенно очевидно, что понимание процессов иммунного ответа требует знания того, какие клетки принимают в них участие и взаимодействуют друг с другом. Один из подходов к изучению иммунной системы, которому отдавалось предпочтение в последние несколько лет, состоял в применении клонального анализа, например методов лимитирующих разведений с использованием клональных клеточных линий. Другой подход, который ни в коей мере не подменяет клональный анализ, а скорее дополняет его, заключается в определении гетерогенности популяций по экспрессируемым маркерам клеточной поверхности. В рамках этого второго подхода весьма популярными стали методы проточной цитометрии и сортировки клеток.
Исходной задачей анализа «фенотипа» клеточной поверхности является обнаружение маркеров, связанных с определенной функциональной способностью клеток. Например, экспрессия поверхностных иммуноглобулинов свидетельствует о потенциальной способности клеток (при наличии соответствующих условий) секретировать антитела.
Задачей проточной цитометрии являются идентификация субпопуляций клеток, определение частоты их встречаемости и получение различных количественных характеристик субпопуляции. Например, при окрашивании спленоцитов антителами против иммуноглобулинов можно: отличить клетки с поверхностными иммуноглобулинами от клеток, не содержащих поверхностных иммуноглобулинов; определить число клеток каждой из таких субпопуляций; выяснить, как много иммуноглобулинов находится на клеточной поверхности (в относительных или абсолютных величинах).
Как следует из самого названия этого метода, проточная цитометрия опирается на измерения некоторых свойств клеток в «проточной системе». Проточная система состоит из специальным образом создаваемого потока жидкости, в который вво-
Методы сортировки клеток в иммунологии
327
дят клетки. В таких системах можно измерять многие параметры: флуоресценцию (которая может давать различную информацию в зависимости от используемых флуоресцентных зондов), светорассеяние, время пролета (время, затрачиваемое клеткой в потоке для того, чтобы пересечь пучок лазера),куль-теровский объем и др. Сортировка клеток (сортинг) — это процесс выделения клеток на основе параметров, измеряемых проточной цитометрией. Таким образом, в рамках этой терминологии все клеточные сортеры являются проточными цитометрами, но не все проточные цитометры обязательно являются клеточными сортерами.
