Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
VII. КЛОНИРОВАНИЕ ИЛ-З-ЗАВИСИМЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В-КЛЕТОК
Эти клетки клонируют в полужидком агаре методом лимитирующего разведения или с помощью микроманипуляций. Мы предпочитаем микроманипуляции. 100 мкл WEHI-KC помещают
312 Глава 18
в круглодонные лунки панелей и инкубируют при 37 °С 30 мин. Небольшое число клеток (<100), суспендированных в WEHI-KC, переносят в культуральные чашки Петри (90Х X15 мм) и с помощью ручной стеклянной микропипетки под контролем инвертированного микроскопа отбирают отдельные клетки, помещают их (по одной) в лунки и инкубируют при 37 °С. Этот метод не требует присутствия вспомогательных клеток, и вся процедура может быть проведена в WEHI-KC. Через 6—8 ч каждую лунку проверяют с помощью инвертированного микроскопа. Лунки, содержащие больше одной клетки, в работе не используют. Каждые три дня 50 мкл среды заменяют на свежую WEHI-KC, до тех пор пока рост клонов не достигает конфлюентности. Клетки в 0,5 мл WEHI-KC переносят в лунки панелей Limbro и наращивают во флаконах для тканевых культур, как было описано ранее.
VIII. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИИ
Сначала характеризуют клеточные линии с помощью набора моноклональных антител (это можно делать на любом этапе работы, когда имеется достаточное число клеток). С этой целью используют антитела к поверхностным антигенам Т-клеток (например, Thy-1, Lyt-1, Lyt-2), зрелых В-клеток (поверхностные IgM, IgD), клеток В-лимфоцитарного ряда (В-220, АА4.1, GF1.2), миелоидных клеток [Jlld, F4/80, Мас-1 (нужно помнить, что Мас-1 реагируют с рецепторами Сз компонента комплемента и что рецепторы С3 были обнаружены на мембранах В- и Т-клеток)]. Обычно применяют как методы иммуно-флуоресцентного окрашивания, так и анализ на клеточном сор-тере. Следует отметить, что ограничиваясь только морфологической и гистохимической характеристиками клеток, можно прийти к ошибочным заключениям. Мы, например, обнаружили, что клетки, которые по ряду клеточных, молекулярных и функциональных свойств относятся к стволовым для В-лимфоцитов, содержат значительную активность а-нафтилацетатэстеразы, хлорацетатэстеразы, кислой фосфатазы, р-глюкуронидазы (присутствующих также в клетках миелоидного и Т-лимфоци-тарного происхождения), но не содержат миелопероксидазы (присутствующей в миелоидных клетках) или терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (которую часто обнаруживают в предшественниках Т-клеток) (Palacios et al., 1984b).
Одно время считали, что в качестве маркера ИЛ-З-зависи-мых клеток лимфоидного происхождения можно использовать 20а-гидроксистероиддегидрогеназу (Ihle et al., 1982а). Этот фермент, однако, не удается обнаружить в достаточно хорошо охарактеризованных ИЛ-З-зависимых предшественниках В-кле-
Условия для получения линий пре-В-клеток
313
ток (R. Palacios, J. Garland, неопубликованные данные), в то время как его, несомненно, содержат клетки миелоидного происхождения (Garland et al., 1982). Следовательно, 20а-гидрок-«систероиддегидрогеназа не может рассматриваться как маркер ИЛ-З-зависимых клеток и не является специфичной для клеток лимфоидного происхождения.
После того как определен фенотип клеточных линий, следует проверить, перестроены ли гены иммуноглобулинов, выявить содержание РНК для тяжелых и (или) легких цепей иммуноглобулинов, оценить способность клеток к созреванию in vitro или in vivo. Все это необходимо для того, чтобы установить, к какой стадии В-клеточной дифференцировки принадлежат клетки исследуемой линии. Соответствующие методики описаны ранее (Palacios et al., 1984а, b), и их обсуждение выходит за рамки настоящей главы.
IX. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Нам удалось получить линии предшественников В-клеток из различных линий мышей, включая животных с генотипом пи/пи и мутацией xid (у которых, как предполагают, нарушено созревание популяции В-клеток). Мы до сих пор не знаем, способствует ли ИЛ-3 размножению всех предшественников В-клеток мыши, или только некой их субпопуляции. Более того, остается неясным, все ли предшественники В-клеток, начинающие пролиферировать в ответ на ИЛ-3, дают начало постоянным линиям, или же некоторые из них под действием ИЛ-3 проходят кратковременный цикл размножения, а затем погибают вследствие генетически ограниченной продолжительности жизни. В настоящее время мы можем лишь утверждать, что при использовании тех препаратов клеток, которые были описаны выше, по крайней мере 1 из 250—500 клеток костного мозга и 1 из 1000.—1500 клеток селезенки дают начало постоянным линиям, имеющим свойства В-клеточных предшественников.
Описана методика (Whitlock, Witte, 1982), позволяющая выращивать пре-В и В-клетки в культуре. По данным ее авторов, жизнеспособность этих клеток зависит от присутствия в культуре неидентифицированных вспомогательных клеток. Неизвестно, используют ли предшественники В-клеток в качестве ростового фактора ИЛ-3, и принадлежат ли они к той же популяции, что и клеточные линии, полученные нами с помощью этого интерлейкина. Наконец, мы хотели бы подчеркнуть, что, хотя ИЛ-3 стимулирует размножение предшественников В-клеток,он не активирует их созревание или дифференцировку (Palacios et al., 1984а, b). Как следует из этого факта, по-видимому, в тех системах, в которых дифференцировку В-клеток оценивают по
