Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
[3 Физические методы исследования белков
193
тушения будет равна:
dn = — pndt — qndt = — (р -f q) ndt.
Отсюда можно получить закон убывания числа возбужденных молекул:
и так как f^pn, то закон затухания флуоресценции имеет вид:
Таким образом, при наличии тушащего процесса второго
С другой стороны, нетрудно видеть, что в рассматриваемом случае доля общего числа возбужденных молекул, которые не испытывают тушения, а перейдут в основное состояние с испусканием кванта флуоресценции, равна —-—. Иными словами,
Р + я
если выход флуоресценции при наличии тушения второго рода равен р, а при его отсутствии ро, то
Таким образом, при всех изменениях величин р и т, происходящих в результате процессов тушения второго рода с постоянной вероятностью q, должна сохраняться строгая пропорциональность между значениями этих величин.
Как видно из рис. 32, Б, это имеет место, например, в очень важном практически случае тушения флуоресценции растворов посторонними примесями.
В случаях, когда вероятность тушения сама изменяется за время пребывания молекулы в возбужденном состоянии [Q'=f(0]> закон затухания принимает более сложный вид и строгая пропорциональность между значениями величин ри т не имеет места. Однако и в этом случае уменьшение выхода флуоресценции всегда сопровождается параллельным, хотя и не строго пропорциональным сокращением ее длительности. Такой случай обнаружил Галанин [62] при изучении концентрационного тушения флуоресценции ряда красителей в вязких растворах (см. рис. 32, В).
Мы видим, что сопоставление величин р и т дает возможность судить не только о характере конкурирующих с флуоресценцией процессов, в частности процессов использования энергии возбуждения в том или ином фотобиологическом процессе, но и о том, остается ли постоянной вероятность этих тушащих
п — пйе
¦~(p+q)t = n0e~t/x,
(55)
(56)
рода т= -------, а при его отсутствии т0 =
Р + Я
1 *
•
Р
— = — или — = — = const,
(57)
Ро То Р Ро
процессов за время пребывания молекулы в возбужденном состоянии.
Ясное и отчетливое понимание этих фундаментальных соотношений абсолютно необходимо для успешного и целенаправленного применения люминесцентных методов к решению проблем физико-химической биологии.
Рис. 32. Соотношения между квантовым выходом и длительностью флуоресценции для различных случаев тушения
А — для флуоресценции хлорофилла в водио-спиртовых смесях (тушение водой) [66]; Б — для тушения флуоресценции раствора хлорофилла в ацетоне хнноном {!) и раствора уранила в воде йодистым калием (2) [67]; Л —для концентрационного тушения флуоресценции растворов флуоресцеина в глицерине [62]
Экспериментальные методы измерения величины т. Как было указано выше, длительность возбужденного состояния флуоресцирующих молекул (т) имеет очень малые по обычным масштабам значения — порядка миллиардных долей секунды. Измерение столь малых интервалов времени и исследование кинетики столь быстро затухающих процессов представляет значительные экспериментальные трудности и требует применения специальных приборов, которые в русской литературе получили название флуорометров. В настоящее время для этой цели применяются почти исключительно так называемые фазовые
флуорометры, принципиальная идея которых была предложена автором этой статьи в 1941 г. [68].
Принципиальная схема такого прибора показана на рис. 33. Возбуждающий пучок света пропускается через то или иное модулирующее устройство М, воздействующее на пучок так, что мощность его после прохождения через модулятор периодически изменяется с частотой 10 ООО 000—20 000 000 периодов в 1 сек. Не нарушая общности рассуждения, можно считать, что эти из-
К
Я/
ФЭУЧ
о
Jм
ФЭУ-2
т
Г, I
?
ФИ
Рис. 33. Принципиальная схема фазового флуоро-метра
менения происходят по простому синусоидальному закону, т. ё. мощность прошедшего через модулятор света изменяется по закону:
I = /0 (1 + т cos at). (58)
Здесь со — циклическая частота модуляции, имеющая значение около 108 гц (со = 2jtf, где f — частота модуляции), а т — коэффициент глубины модуляции (отношение амплитуды переменной составляющей потока к постоянной составляющей) .
Этот модулированный поток света делится прозрачной пластинкой D на две части: одна (около 8%) отражается от пластинки и действует на фотоэлектрический приемник ФЭУ-2 (фотоэлектронный умножитель), в котором возникает электрический ток, изменяющийся по закону (58). Другая, большая часть света возбуждает флуоресценцию исследуемого вещества в кювете К, и свет флуоресценции воздействует на другой приемник — ФЭУ-1.
Нетрудно понять, что при возбуждении модулированным (периодически изменяющимся) пучком свет флуоресценции также будет промодулирован с той же частотой. Но так как свет задерживается в флуоресцирующем веществе на некоторое среднее время т, то фаза модуляции света флуоресценции будет отставать от фазы возбуждающего света на некоторый угол ср. Расчет показывает, что при этом и глубина модуляции флуоресценции несколько уменьшится. Таким образом, закон изменения интенсивности света флуоресценции и тока в приемнике ФЭУ-2 имеет вид:
