Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Во всех измерительных установках, где плоскость поляризации действующего на приемник света' поворачивается, необходимо учитывать, что чувствительность фотоэлектрических приемников, особенно приемников с массивными, а не полупрозрачными
катодами довольно заметно зависит от ориентации плоскости поляризации относительно катода. Для устранения этого искажающего измерения и трудно контролируемого фактора необходимо помещать между анализатором и приемником деполяризатор, превращающий частично поляризованный свет в деполяризованный. В описанной установке [91] в качестве такого деполяризатора применялась пластинка из молочного стекла, сильно ослаблявшая интенсивность действующего на приемник света. В настоящее время мы применяем псевдодеполяризатор —вращающуюся вместе с анализатором клиновидную пластинку из кварца или исландского шпата. Такая пластинка не дает истинно деполяризованного света, но создает такую смесь различных форм поляризации, которая практически не отличается от деполяризованного света (о других псевдодеполяризаторах см. в книге Шерклиффа [92]).
Для устранения указанного осложняющего обстоятельства было предложено [93] вращать не анализатор,- а бикварц, т. е. круглую пластину, состоящую из двух склеенных по диаметру пластин из право- и левовращающего кварца, сохраняя перед приемником неподвижный анализатор. Такая же установка была использована [94] с применением неподвижного анализатора и вращающейся пластинки, создающей сдвиг фазы К/2 между право- и левоциркулярнополяризованными компонентами. Недостаток всех этих схем — их сильная хроматичность, т. е. зависимость угла поворота плоскости поляризации (в случае бикварца) или сдвига фаз (в случае пластинки) от длины волны света.
Факторы, определяющие степень поляризации флуоресценции. Как ясно из сказанного, степень поляризации флуоресценции определяется двумя различными по своей природе группами факторов: 1) углом между направлениями осей поглощающего и излучающего осциллятора, который зависит от строения молекулы, и 2) поворотом молекулы за время х, который определяется, с одной стороны, условиями внешней среды (ее температурой и вязкостью), а с другой — объемом самой молекулы (вместе с ее сольватационной оболочкой) и степенью ее асимметрии. Последний фактор имеет особое значение при изучении высокополимерных молекул, в частности белков и нуклеиновых кислот.
Влияние первого фактора проявляется в том, что предельная поляризация флуоресценции (или вообще поляризация при неизменных внешних условиях) зависит от длины волны возбуждающего света. На рис. 39 приведены примеры таких «поляризационных спектров», т. е. кривых, изображающих зависимость величины р от Авозб. для ряда красителей. Как видно из рисунка, при переходе от одной полосы поглощения к другой может меняться не только величина, но и знак степени поляризации.
Объяснение этого Явлений заключается в том, Что осцилляторы, характеризующие различные полосы поглощения (различные электронные переходы),по-разному ориентированы относительно осей молекулы и образуют различные углы с диполем излучения. Этим же объясняется и то, что предельная поляризация различных веществ может иметь резко различные значения. Так, например, по измерениям Феофилова [43], величина р0, равная для акридина 17,1%, закономерно изменяется в ряду его производных, достигая значения 40% для 3,6-диаминоакридина.
Рп
0,30 0J0 0,10 о
п
щ од 0,10 о
4
Рнс. 39. Поляризационные спектры люминесценции красителей (Вавилов)
1 — родамин Б; 2 — магдановый красный; 3 — эскулин; 4 — флоуресценн
Вопрос о поляризационных спектрах и их связи со структурой молекул рассмотрен Феофиловым [43]. Не останавливаясь на этом подробно, отметим, что возможности применения поляризационных спектров для изучения строения и симметрии сложных органических молекул, продемонстрированные Феофиловым на примере ряда красителей, почти не использованы в биохимии и химии биологически важных соединений. Это, несомненно, «золотоносная жила», еще ожидающая своих первооткрывателей.
Шире, хотя и в недостаточной мере, используются в биохимии и молекулярной биологии методы, связанные с изучением вращательной деполяризации флуоресценции, т. е. с изучением влияния второй группы факторов, уменьшающих степень поляризации флуоресценции в тех или иных условиях по сравнению с предельным значением этой величины, определяемым только строением молекулы и длиной волны возбуждающего света.
Представим себе, что в некоторый момент времени возбуждающее излучение создало анизотропию возбужденных молекул,
Рп
т. е. что в растворе существует определённая группа молекул, у которых оси излучающих диполей ориентированы параллельно или имеют одно и то же преимущественное направление. Если мы предоставим эту группу молекул самой себе, то в результате случайного броуновского вращения, испытываемого каждой молекулой, эта анизотропия будет постепенно «рассасываться» и через некоторое время практически исчезнет. Это время мы будем называть «временем релаксации» для броуновского вращательного движения молекул. Наблюдаемая степень поляризации флуоресценции определяется тем, в какой мере эта анизотропия еще сохранится к моменту излучения флуоресценции. Иными словами, степень поляризации флуоресценции должна зависеть от соотношения между длительностью возбужденного состояния т и временем релаксации оптической анизотропии 0. Если т<С0, как это, например, имеет место при очень низкой температуре или очень высокой вязкости раствора, то броуновское вращение практически не успеет нарушить первоначальную анизотропию возбужденных молекул, и степень поляризации будет иметь предельное значение р0. Напротив, при т, сравнимом с 0, что имеет место для растворов малой вязкости и при комнатной температуре, анизотропия рассосется за время т почти полностью, и степень поляризации будет очень низка.
