Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
1 Строго говоря, квантовый выход флуоресценции остается постоянным ие только в стоксовской, но и в несколько более широкой области спектра, вплоть до некоторой частоты возбуждающего света v0, которая примерно соответствует частоте чисто электронного перехода между основным и первым возбужденным уровнем.
lg/„
о,о
1,0
Флуоресцеин вводе ¦"
Флуоресцеин в глицерине"0~“
Флуоресцеин в спирте
¦т \\М/0‘
V у\\t-Sff'
\ \\t=20’
t=a/r 1 \t-W"
550 V
600
Рис. 31. Зависимость квантового выхода флуоресценции растворов флуоресцеина в воде, глицерине и спирте от длины волны возбуждающего света и температуры [57]
молекула «успевает забыть» о том, в каком состоянии она находилась непосредственно после возбуждения. Причины падения выхода при антистоксовском возбуждении описаны в литературе [40, 42, 61].
д. Процессы тушения флуоресценции
Квантовый выход флуоресценции, в отличие от ее спектра, не есть некоторая постоянная величина, характеризующая данную молекулу как таковую. Напротив, его значения очень сильно зависят от различных внешних факторов: природы и свойств растворителя, температуры, концентрации флуоресцирующего вещества, наличия в растворе тех или иных посторонних веществ и т. п. Хотя в некоторых случаях значения квантового выхода могут быть очень велики (например, для водных и спиртовых растворов флуоресцеина р=0,75), значения р всегда меньше единицы и изменяются в очень широких пределах, что указывает на то, что наряду с так называемыми радиационными переходами молекулы из возбужденного состояния в основное, т. е. переходами, при которых избыток энергии излучается в виде кванта флуоресценции, существуют и различные другие, конкурирующие с флуоресценцией процессы нерадиационных переходов, при которых избыток энергии либо переходит в иную форму, либо передается другой молекуле. Все процессы такого рода, уменьшающие в той или иной степени квантовый выход флуоресценции, можно назвать процессами ее тушения.
Физические механизмы этих процессов весьма разнообразны. Они могут быть связаны как с внутримолекулярными, так и с межмолекулярными процессами, т. е. с процессами взаимодействия возбужденной молекулы флуоресцирующего вещества с молекулами растворителя или с некоторыми молекулами, находящимися в растворе.
В первом случае речь идет о так называемом процессе внутренней конверсии энергии электронного возбуждения, т. е.
о размене этой энергии по тепловым степеням свободы молекулы. В результате этого .мы получаем молекулу, находящуюся в основном электронном состоянии, но обладающую большим запасом колебательной энергии. Такая «горячая» молекула очень быстро отдает свой избыток тепловой энергии в окружающую среду и приходит в тепловое равновесие с ней.
Среди процессов межмолекулярного тушения некоторые осуществляются в результате соударения возбужденной молекулы с какими-то другими молекулами, находящимися в растворе. Эти процессы обусловлены диффузией молекул за время их пребывания в возбужденном состоянии, и эффективность их зависит от вязкости и температуры среды. 'В других случаях может иметь место передача энергии возбуждения от данной
молекулы ;К некоторой другой без прямого соударения их — в результате так называемой индуктивной, или резонансной, миграции возбуждения [61—64].
Общая классификация весьма разнообразных процессов тушения была установлена С. И. Вавиловым [65]. По Вавилову, следует различать процессы тушения «мгновенные», т. е. происходящие за время, значительно меньшее, чем длительность возбужденного 'состояния, и 'процессы, при которых конкуренция между флуоресценцией и тушащим шроцессом имеет место во все время пребывания молекулы в возбужденном состоянии. Эти процессы иринято называть соответственно «тушением первого рода» и «тушением второго рода».
Когда мы имеем дело с тушением первого рода, то в растворе молекулы находятся в двух различных формах или состояниях: одни из них гаснут «мгновенно», т. е. являются нефлуоресцирующими, а на другие данный тушащий процесс не влияет. Наблюдаемое нами в этих случаях изменение квантового выхода флуоресценции обусловлено сдвигом в ту или иную сторону равновесия между молекулами, находящимися в флуоресцирующем и нефлуоресцирующем состоянии или форме. Это частный случай сдвига равновесия между различными формами или состояниями данной молекулы, каждая из которых характеризуется своим значением квантового выхода. При тушении первого рода для одной из этих форм р = 0.
В случае процессов второго рода во все время пребывания молекулы в возбужденном состоянии существует определенная вероятность (р) того, что возбужденная молекула испустит квант излучения, и определенная вероятность (q) того, что она за это время растратит свой запас электронной энергии безиз-лучательным путем. Наблюдаемое 'в том или ином процессе изменение квантового выхода отражает изменение вероятности последнего процесса, т. е. величины q.
Экспериментальным критерием для различия процессов первого и второго рода является сопоставление изменений выхода и длительности флуоресценции. Это будет показано в следующем разделе статьи. Там же мы постараемся на нескольких примерах показать, какое большое значение имеет классификация Вавилова для исследования ряда проблем молекулярной биологии.
