Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
/ =/0 [ 1 + tfia cos (со/— <р)], (59)
где а<1.
При экспоненциальном законе затухания флуоресценции (56) связь между сдвигом фазы <р, множителем а и величиной т очень проста:
tg ф = cot; а = cos ф. (60)
Таким образом, для измерения величины т оказывается достаточным измерить сдвиг фазы между токами, возникающими в приемниках ФЭУ-1 и ФЭУ-2. Это осуществляется при помощи хорошо разработанных в современной радиотехнике фазоизмерительных устройств (ФИ на рис. 33).
. Реализация этой принципиальной схемы — осуществление высокочастотной модуляции, усиление слабых фототоков высокой частоты и точное измерение сдвига фазы между ними — требует применения довольно сложных электронных и оптических устройств [69—73].
Пр и меры применения флуорометрических измерений в проблемах молекулярной биологии. Из того, что было сказано выше о связи между длительностью и выходом флуоресценции при наличии процессов тушения второго рода, следует, что биологическими процессами, в изучении которых применение люминесцентных методов представляется наиболее перспективным, являются процессы фотобиологические, в первую очередь процессы фотосинтеза. Поскольку во всех процессах этого рода большая или меньшая часть поглощенной световой энергии должна быть израсходована на осуществление той или иной фотохимической реакции и аккумулирована в ее первичных продуктах, то по отношению к флуоресценции все первичные акты этих процессов носят характер специфического тушения, дополнительного к тем процессам тушения, какие имеют место in vitro (в растворах).
Поэтому все эти процессы должны привести к уменьшению квантового выхода флуоресценции, а в тех случаях, когда они являются процессами второго рода,— и к сокращению ее длительности.
Так, например, уже сравнительно давно известно, что флуоресценция' хлорофилла in vivo, т. е. в клетках фотосинтезирующих организмов, значительно слабее, чем в растворах этого пигмента в спирте, эфире, ацетоне и в других растворителях. Если в растворах квантовый выход флуоресценции достигает 25—30%, то в клетках он примерно раз в 10 меньше [74]. В 1957 г. в трех лабораториях независимо друг от друга были впервые произведены измерения длительности флуоресценции хлорофилла in vitro и in vivo [75—77].
Оказалось, что и величина т для клеток значительно меньше, чем для растворов, хотя строгой пропорциональности между значениями ри т нет. Если для растворов величина т имеет значение 5—6 наносекунд (10-9 сек), то для фотосинтезирующих клеток значения т лежат около 1 наносекунды. Это указывает на то, что конкуренция за энергию возбуждения молекулы пигмента между первичным фотосинтетическим актом и флуоресценцией происходит во все время пребывания молекулы в возбужденном состоянии, но вероятность этого первичного акта не остается в тече-
ние этого времени постоянной. По-видимому, это можно объяснить так же, как и аналогичные соотношения в случае концентрационного тушения в вязкой среде [62].
В клетке конкуренция между фотосинтезом и флуоресценцией складывается решительно в пользу первичного фотосинтети-ческого акта. Сокращение выхода в 10 раз указывает на то, что примерно 90% возбужденных молекул дезактивируются не путем флуоресценции или внутренней конверсии, а через первичную фотохимическую реакцию. Этим, естественно, объясняется высокий квантовый выход реакции, в которой для фотосинтеза используется не только энергия, затрачиваемая в растворе на флуоресценцию, но и значительная доля энергии, обычно превращающейся в тепло.
С этой точки зрения можно было бы ожидать, что все факторы, вызывающие уменьшение эффективности первичного фото-синтетического акта, будут приводить к возрастанию выхода и длительности флуоресценции хлорофилла и, наоборот, всякое возрастание эффективности первичных фотосинтетических процессов должно сопровождаться уменьшением значений р и т. Исследователям [66] удалось показать, что при действии различных ингибиторов фотосинтеза величины р и т возрастают, достигая тех значений, какие они имеют в растворах. Напротив, по мере формирования фотосинтетического аппарата при освещении этиолированных (выращенных в темнотеУ листьев значения р и т падают. Все эти данные позволяют рассматривать значения величины т как очень удобную меру степени эффективности первичного фотосинтетического акта.
При помощи этого критерия можно было показать [78], что этот первичный акт, который, согласно современным представлениям о механизме фотосинтеза, нужно представлять себе как процесс передачи электрона от возбужденной молекулы хлорофилла к первичному акцептору (ферредоксину), является в широком температурном интервале температуронезависимым, т. е. что он представляет собой не обычную химическую реакцию, контролируемую температурой и диффузией, а электронный, фото-физический процесс, связанный, вероятно, с образованием так называемых комплексов с переносом заряда (charge transfer complex). Этот же критерий дал возможность довольно детально проследить за процессом фотохимического превращения протохлорофилла в хлорофилл в процессе зеленения этиолированных листьев [79].
