Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 29. Перенос кусочков ткани из смеси метакрилатов в желатиновые капсулы для полимеризации
метакрилат, предварительно лолимеризованный (предполимер) при температуре 60—80° до сиропообразного состояния, с другой — использовать для последующей полимеризации более высокую температуру — 60°. Дегазация мономеров метакрилата также является мерой борьбы с полимеризационными повреждениями. При добавлении к метакрилатам дивинилбен-зола образуются трехмерные структуры полимера, что предотвращает изменение образцов при полимеризации и делает их более устойчивыми к пучку электронов [76].
За рубежом в качестве заливочных материалов с успехом применяют эпоксидные смолы (Аралдит, Эпон) и полиэфиры (Вестопал W). Для увеличения контрастности изображения объекты при заливке в эпоксидные смолы необходимо дополнительно окрашивать (см. ниже).
Эти приемы заливки объектов страдают общим недостатком, а именно, объекты необходимо проводить через ряд сред, экстрагирующих различные химические компоненты клетки. Было бы чрезвычайно важно использовать в качестве заливочных сред вещества, хорошо растворимые в воде, но попытки применения таких сред (желатин, аквон) пока не увенчались большим успехом [72, 77],
Стеклянные ножи, используемые для ультрамикротомирова-ния, не позволяют делать больших площадей срезов из-за своей хрупкости и небольшой поверхности лезвия, годной к резке. С другой стороны, размеры срезов ограничиваются размером сеток-подложек (до 3 мм в диаметре). Кроме того, размер самой ткани, фиксированной для электронной микроскопии, также невелик. И, наконец, напряжения и вибрации, возникающие прн резке объектов, залитых в твердые пластмассы, создали необходимость использовать для изготовления ультратоиких срезов очень небольшие площади объектов, составляющие чаще всего несколько десятых долей квадратного миллиметра (вполне возможно получить хорошие срезы площадью 4 мм2 каждый). Чем меньше площадь среза, тем лучше и равномернее будут срезы. Так как наименьшая площадь среза может быть получена с вершины пирамиды, то обычно объект, заключенный в пластмассу, затачивают на пирамиду или призму (рис. 30).
Одним из самых важных моментов при получении ультра-тонкнх срезов с заточенных блоков клеток и тканей является процесс изготовления ножа для резки. За последние 10 лет было предложено большое число методов приготовления ножей из различных материалов (сталь, стекло, корунд, алмаз).
Рис. 30. Зажатый в держатель блок с заключенным в нем объектом затачивается перед резкой
Рис. 31. Ножи, применяемые для изготовления ультратонких срезов
а, 6 — стеклянные ножи; на один из ник надета специальная ванночка для жидкости, на поверхности которой .собираются срезы; в — специальный держатель алмазного ножа;
1 — режущий край ножа; 2 — алмазный нож
Стеклянные ножи, впервые введенные в практику получения ультратонких срезов «Патта и Хартманом [78}, нашли очень широкое применение благодаря доступности и значительно меньшей трудоемкости процесса их изготовления. В качестве режущего лезвия стеклянного ножа служит торцевая линия (кромка) скола стекла, произведенного под углом 45—55° (рис. 31). Для этого на полосках или квадратах толстого (4—6 мм) стекла делаются стеклорезом диагональные насечки. Затем такие квадратики разламываются по линиям насечек. Ширина полосок или квадратов стеклянных заготовок обычно бывает 25 мм. Установлено, что наилучшее качество лезвия получается у ножей, изготовленных из сортов стекла с повышенным содержанием кремния.
Для получения ультратонких срезов хорошего качества очень важно, чтобы ножи не имели на своей режущей кромке зазубрин или изъянов. Процент стеклянных ножей, после изготовления пригодных для резки, невелик, их кромка очень хрупка -и поэтому их нельзя использовать повторно. Более долговечны и стабильны алмазные ножи [79], имеющие к тому же большую протяженность режущего края (см. рис. 31).
Изготовление ультратонких срезов производится при помощи специальных приборов — ультра микротомов (обзор конструкции см. [10]). В принципе их работа заключается ъ том, чтобы в процессе резки равномерно на одинаковую величину подавать объект к ножу. Так как толщина срезов должна быть всего лишь в несколько сот ангстрем, то и подача объекта также должна быть равной этой величине. Такую незначительную подачу можно осуществить, используя либо тепловое расширение
Рис. 32. Расположение в ультрамикротоме держателя алмазного ножа (/) й образца (2), который движется вперед за счет теплового расширения и одновременно перемещается в вертикальной плоскости (показано стрелкой);
3 — сетка с пленкой-подложкой, на которую монтируются ультра тонкие срезы
металлических стержней, на которых крепится объект, либо точную микрометрическую подачу с последующей редукцией подачи на рычагах. Соответственно этим принципам современные модели ультрамикротомов можио разделить на два типа: с тепловой и с механической подачей. К первому типу относится шведский ультрамикротом Шестранда, универсальный «Ультратом-4800» шведской фирмы LKB, модель австрийской фирмы «Рейхерт», японский микротом JUM-5, советские модели УМД-5, УМД-2 и др. К микротомам с механической подачей относятся ультрамикротомы Портера — Блюма и Хаксли.
