Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
о
о
о
о
о
Рис. 17. Схематическое изображение одной и той же молекулы, обработанной по методике Кляйншмидта, оттененной с вращением образца (а) и в одном направлении (б)
заставляет использовать вращение препарата в процессе контрастирования молекул оттенением. Принципиальная схема установки для оттенения с вращающимся столиком объекта показана на рнс. 5, б. Столик вращается при помощи электромотора и делает 2 об/сек.
На рис. 15 приведена типичная микрофотография молекулы ДНК фага Т2. Образцы для электронномикроскопических исследований подготавливали по второму варианту методики. Видно, что в условиях работы с белковой пленкой можно получить микрофотографии длинных молекул, располагающихся на сравнительно небольших участках площади пленкн.
На рнс. 16 показан тот же препарат, но контрастнрованнын в одном направлении. Картина оказывается совершенно другой, благодаря тому, что участки молекул, ориентированные вдоль направления оттенения, совершенно не выявляются. Для большей наглядности на рис. 17, а, б показано (соответственно), как выглядит молекула при оттенении с вращением образца и как должна выглядеть прн одностороннем оттененин.
Важным обстоятельством является то, что, в отличие от микрофотографий ДНК, полученных при помощи других методов, в данном случае толщина молекул, контрастированных оттекеин-ем, составляет 50—80 А. Такое увеличение диаметра связано с образованием комплекса нуклеиновая кислота—-белок. Некоторое увеличение толщины молекул (на 10—20 А) может дать круговое напыление металлом.
Схематическое изображение предполагаемой картины распределения металла при оттененни со всех сторон объекта цилиндрической формы показано на рис. 18. В этом случае нет
Рис. 18. Распределение металла при оттененин со всех сторон объекта цилиндрической формы
участков, на которых отсутствовал бы слой металла, но есть участки с пониженной толщиной этого слоя, расположенные по сторонам цилиндрического объекта, непосредственно на котором слой достигает наибольшей толщины.
Метод белковой пленки успешно применяли для исследования однотяжевой ДНК некоторых фагов [57]. Основная трудность при этом заключается в том, что однотяжевая нуклеиновая кислота не обладает жесткостью, присущей двутяжной, и в растворе имеет форму рыхлого клубка. Чтобы развернуть этот клубок, нужно готовить препарат для электронной микроскопии при низкой ионной силе, а также в условиях, препятствующих ренатурацни, если речь идет о денатурированной ДНК (сильно щелочное pH, присутствие формальдегида). На рнс. 19 представлена микрофотография частично денатурированной ДНК фага Т2, где наряду с двухнитевымн участками видны фрагменты однонитевой ДНК.
Некоторые вирусы прн резком снижении ионной силы раствора выбрасывают свою нуклеиновую кислоту. Используя метод Кляйншмидта, это явление можно наблюдать электронномикроскопически [58]. Для этого суспензию фага Т2 в 8 М аммоннй-ацетатном буфере смешивали с цитохромом с и 0,4 мл смеси наносили на поверхность того же буфера, но с 0,01 М. В образовавшейся белковой пленке некоторые частицы фага выбрасывали ДНК, которая располагалась вокруг фаговой частицы. Аналогичного эффекта можно добиться и другим путем. Мы наносили мелкие каплн взвеси фаговых частнц в 5 М аммоннй-ацетатном буфере на внутреннюю поверхность колбы. Затем в колбу наливали воду и тщательно перемешивали. К 1 мл
Рис. 19. ДНК фага Т2. Обработка по методике Кляйншмидта с последующим оттенением вращающегося образца. Молекулы частично денатурированы. На одной из них наблюдается расхождение двухспиральной структуры на полинуклеотидпые цепочки, одна из которых разорвана. На копие другой молекулы виден клубок, образованный полииуклеотидными
цепочками
I-
Рис. 20. Фаг Т2, выбросивший ДНК
взвеси частиц в воде прибавляли 0,15 мл раствора цнтохрома с (концентрация 400 мкг/мл) и 0,4 мл смеси наносили на поверхность дистиллированной воды. Микрофотография частицы фага, окруженной выброшенной ДНК, показана на рнс. 20.
До сих пор мы рассматривали контрастирование молекул нуклеиновой кислоты оттенением. Эта методика контрастирования нуклеиновых кислот пока наиболее распространена. Вместе с тем она имеет и свои недостатки. В силу специфики метода выявление тонкой структуры молекул ограничивается величиной зерна напыленного слоя металла. Между тем исследование де-талей строения молекул нуклеиновых кислот, например их вторичной структуры, доступно для электронномикроскопнческнх исследований. Чтобы это можно было осуществить, необходимо разработать новые методы контрастирования.
Контрастирования ДНК можно достигнуть присоединением к ее молекулам ноиов тяжелых металлов. В рассмотренном выше исследовании [56] наряду с оттенением металлами препараты нуклеиновых кислот, полученные методом белковой пленки, контрастировали солями тяжелых металлов. Для этого высушенные сетки с белковой пленкой помещали на поверхность 2%-ного раствора уранилацетата (pH 5,0) пленкой вниз на 10— 15 мин. После высушивания препараты иссследовалн в микроскопе при увеличении 25 000. Толщина молекул нативной ДНК при этом способе контрастирования составляет 20—25 А, т. е. соответствует истинной толщине (рис. 21).
