Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 39

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 133 >> Следующая

Судить о трехмерной структуре объекта, изучая срезы, довольно трудно, но, исследуя морфологию клеток, рассеченных в разных плоскостях, или восстанавливая общую их структуру при помощи исследования серийных срезов, можно получить полное и точное представление об истинных размерах и форме всех компонентов клетки.
Исследование ультратонких срезов биологических объектов открыло новую страницу в биологии. За последние годы в изучении ультраструктуры клеток были достигнуты огромные успехи, на основе которых мы теперь имеем довольно полное представление о тонком строении клеток и составляющих их частей (рис. 22—27).
Оказалось, что для успешного изучения клеток и тканей необходимо иметь срезы, толщина которых должна быть в пределах 300—600 А, т. е. в 100 раз меньше толщины срезов, которые применяются в обычной световой микроскопии. В последнем случае ткани пропитываются парафином, но из-за его мягкости и хрупкости из таких объектов невозможно получить ультратонкие срезы. Поэтому электронная микроскопия не имела успехов до тех пор, пока не были найдены новые заливочные материалы — пластмассы, такие, как метакрилаты, эпоксидные смолы и т. д.
Заливке объектов в такие среды должны предшествовать процессы фиксации и обезвоживания материала, чтобы эти вещества свободно пропитали всю ткань.
Первым необходимым звеном в процессе изучения объектов на ультратонких срезах является фиксация клеток.
а. Фиксация
Мы пока еще не можем при помощи электронного микроскопа проникать в структуру внутренних компонентов живых клеток, тем более невозможно изготовить из них срезы нужной толщины.
7 Физические методы исследования белков 97
Поэтому приходится прибегать к такой химической или иной обработке клеток, при которой они убивались бы, но при этом ие происходило бы изменений структур, их размеров, молекулярного строения, дислокации веществ или их потери. К сожалению, применяющиеся в настоящее время химические вещества для фиксации, стабилизации клеток и их компонентов одновременно всем этим требованиям не удовлетворяют. Убивая клетку, они убивают и ее ферменты, денатурируют белки или растворяют их, вызывая ряд изменений в клеточных структурах. Некоторые фиксаторы сохраняют одни клеточные компоненты, но при этом изменяются другие; иные фиксаторы, не изменяя сильно химизма одних структур клеток, приводят к изменению или даже к потере других. Пока что не иайдеи «идеальный» фиксатор, который сохранял бы в нативном состоянии химизм и структуру клеток.
Одиако, несмотря на такую, казалось бы, пессимистическую предпосылку, все же были достигнуты большие успехи в ультра-структурном изучении клеток, благодаря применению различных химических веществ для фиксации. Сравнительный анализ результатов воздействия разных фиксаторов и физических, обработок на клетки позволяет говорить о принципах организации клеток, которые существуют и in vivo.
Наиболее удачными фиксаторами в электронной микроскопии оказались вещества, которые, вступая в реакцию с белками и липидами, связывают их и стабилизируют. Самыми распространенными нз них являются четырехокись осмия, формалин и перманганат калия.
Четырехокись осмия (OSO4) удачно используется в качестве фиксатора для клеток в электронной микроскопии ие только потому, что она хорошо сохраняет клеточные компоненты, но и потому, что, связываясь с ними, одновременно их и «окрашивает». При этом осмий, осажденный на структурах, в силу своего большого атомного веса отклоняет электроны и тем самым как бы контрастирует структуры.
Взаимодействие четырехокиси осмия как сильного окислителя с клеточными структурами очень сложно и многообразно. Она интенсивно связывается с белками, со многими аминокислотами, мало связывается с РНК и почти не реагирует с ДНК [60]. Четырехокись осмия может соединяться с аминогруппами в по-липептидных цепочках и тем образовывать между ними связи, что определяет прекрасную сохранность белковых структур. Но при продолжительном воздействии из-за глубокого окисления такие связи рвутся и белки могут быть вымыты при дальнейшей обработке в водных средах. Было показано [61], что в результате длительной фиксации в четырехокиси осмия может быть потеряно до 22,6% белка из тканей и еще до 12% при дальнейшем обезвоживании. В ненасыщенных жирных кислотах четырехокись осмия образует прочные связи между соседними цепоч-
Рис. 28. Фиксация и обезвоживание объектов. Мелкие кусочки ткани помещаются в фиксирующий раствор, затем переносятся в сосуды со спиртом повышающейся концентрации, после чего пропитываются в смеси метакрилатов
ками, в результате чего оии становятся устойчивыми к дальнейшей обработке. Осмий надело подавляет большинство ферментов в клетках и поэтому как фиксатор непригоден для гистохимических исследований. Одним из минусов применения осмиевых фиксаторов является их медленное проникновение в ткани (0,5 мм за 1 час). Вследствие этого периферические участки ткани фиксируются хорошо, тогда как внутренние могут подвергаться аутолитическим процессам и разрушаться. Поэтому обычно фиксируют мелкие (до 1 мм3) кусочки тканей в осмиевых растворах, охлажденных до 4° (охлаждение любых фиксаторов рекомендуется для предотвращения автолиза клеток) (рис. 28). Время фиксации должно быть таким, чтобы четырехокись осмия прореагировала со всеми слоями объекта (0,5—1,5 часа). Конечно, для фиксации одиночных клеток или однослойных клеточных культур время фиксации может быть значительно короче (15—30 мин.). Хорошие результаты фиксации достигаются при перфузии органов растворами четырехокиси осмия [62].
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed