Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Исследование распределения заряда в биологически активных молекулах. Изменение электронной плотности влияет на химические сдвиги и дает возможность исследовать распределение заряда в молекуле. Например, спектр ЯМР пиридина показывает, что электронная плотность распределена таким образом, что примерно 60% заряда локализуется на атоме азота [14].
В общем случае, когда химические группы присоединены к ароматическим кольцам, резонанс наблюдается при более низких полях, чем в случае алкилпроизводных, под действием «кольцевых токов».
Спектры ЯМР порфиринов [15] отчетливо- показывают наличие в кольце большого Тока, обусловленного системой л-электро-нов. Однако простой учет этого тока не мог объяснить разницы, наблюдаемой в химических сдвигах отдельных протонов молекулы. Удовлетворительное объяснение дает гипотеза Полинга, использованная при вычислении диамагнитной анизотропии по-лициклических систем. Полинг трактовал углеродный скелет таких соединений как проводящую электрическую сеть, причем электромагнитное поле считалось пропорциональным площади, заключенной в каждой петле тока, а сопротивление — числу связей.
Электроотрицательные группы, такие, как ОН, NH2, С = 0, сдвигают резонансные пики в область более низких полей, когда они присоединены к соединениям с открытой цепью, так как уменьшают электронную плотность у магнитного ядра. При присоединении к ароматическим веществам они вызывают сдвиг пиков в противоположном направлении, что можно объяснить нарушением свободной циркуляции электрона по кольцу и, таким образом, уменьшением эффекта наведенного тока кольца [7].
Увеличение экранирования СН-протонов при помощи электроотрицательных заместителей наблюдалось для пуринов и пи-римидинов [16].
Наши знания о распределении электронной плотности в кольцах пуриновых и пиримидиновых оснований в растворе весьма недостаточны. Как известно, эти соединения обладают высокой специфичностью в ферментативных реакциях, а различные их производные выполняют роль метаболитов или антиметаболитов. Поэтому получение данных о распределении заряда и конформации этих молекул в различных биологических соединениях весьма существенно для понимания их функционирования.
Некоторые авторы сопоставляют связь канцерогенности по-лициклических ароматических соединений с характеристическим распределением электронной плотности в них [17]. Методом ЯМР можно получить экспериментальные данные, подтверждающие или опровергающие гипотезу о наличии такой корреляции.
Исследование конформации* или вторичной и третичной структуры. Спин-спиновое расщепление, появление разных Сигналов для химически эквивалентных ядер, избирательное изменение ширины линии и другие характеристики спектров ЯМР могут дать ценную информацию о конформации молекул.
Исследование компонент нуклеиновых кислот — пуринов и пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотидов — методом ЯМР [16, 18—21] позволило получить существенные данные об их конформации в растворе. Например, было установлено, что кольца ри-бозы и дезоксирибозы не являются плоскими, причем конформация кольца рибозы зависит от вида нуклеотида [18], а конформация нуклеотида — от наличия рибозы или дезоксирибозы [19—21].
Для объяснения роли адениновой части молекулы аденозйн-трифосфорной кислоты (АТФ) в ферментативных реакциях с участием двухвалентных ионов металла некоторые авторы предполагали, что комплекс металлфосфат может загибаться назад на аденин, образуя при этом хелатную структуру. Этот процесс вызвал бы перераспределение электронной плотности в плоскости аденинового кольца, что может быть зарегистрировано методом ЯМР по изменению химических сдвигов. Однако экспериментально было показано, что химические сдвиги протонов в
положении В, 2 и 1 одинаковы для АТФ, Mg-АТФ и Са-АТФ [22, 23]. Этот факт заставляет считать, что предполагаемая конформация для комплексов Mg++ и Са++ с АТФ в условиях эксперимента маловероятна.
Были обнаружены корреляции между конформацией белков в растворе и характером их спектров ЯМР. В отличие от низкомолекулярных веществ движение молекулы полимера как целого не может вызвать усреднения локальных полей, достаточного для получения высокоразрешенного спектра ЯМР. С увеличением молекулярного веса, как правило, разрешенность спектра белка
Рис. 10. Спектры протонного магнитного резонанса 20%-ной рибонуклеазы
в D20
Л—спектр рибонуклеазы; 5 —то же, в присутствии 8 М мочевины; В—спектр окислен*
ной рибонуклеазы
ухудшается. При этом нужно учитывать, что степень разрешенное™ спектра и ширина сигнала ЯМР для полимера в растворе зависят главным образом от сегментарной подвижности полимерных цепей, уменьшающей диполь-дипольные взаимодействия. В случае глобулярных белков такая подвижность в значительной мере затруднена из-за внутримолекулярных связей. Эти связи приводят к образованию специфической конформации в виде компактной сферы или эллипсоида и для многих белков в нативном состоянии спектр ЯМР вообще не наблюдается.
