Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Водородная связь. Резонансный пик протонов, связанных водородной связью, наблюдается при более низких полях, чем для протонов, присоединенных к тому же атому в отсутствие
и
A JL
-SMH/Z .а +$мН/2
водородной связи. Это происходит за счет уменьшения в результате электростатического взаимодействия эффективной электронной плотности у протона. Например, измерение химических сдвигов протонов воды в концентрированных растворах бычьего сывороточного альбумина показало, что при этом не происходит изменения числа водородных связей по сравнению с чистой водой i[33]. Так как в бычьем сывороточном альбумине имеется около 40% гидрофобных остатков, Бови заключил, что на гидрофобных частях белка водородные связи молекул воды друг с другом приводят к образованию ориентированных слоев воды.
Взаимодействие воды с биологическими структурами. Многочисленные данные ЯМР по взаимодействию воды с биополимерами не позволяют в настоящее время сделать однозначных выводов о характере такого взаимодействия. Этот вопрос подробно рассмотрен нами в специальном обзоре по применению ЯМР в биологических исследованиях [8].
Комплексообразование с металлами. При помощи ЯМР получено первое прямое доказательство различия фосфатных групп АТФ в образовании комплексов с металлами [26]. Химические сдвиги фосфорных пиков показывают, что ионы Mg++, Са++ и Zn++ образуют комплексы преимущественно с двумя концевыми фосфатными группами АТФ.
Определение химических групп, участвующих в образовании специфических комплексов. С этой целью были проведены исследования взаимодействия пенициллина и стрептомицина с сывороточным альбумином [34] и комплекса энзим — коэнзим в случае никотинамиддинуклеотида (НАД) и алькогольдегидразы [35]. Применение ЯМР в исследованиях такого рода ограничено малой чувствительностью метода, требующей сравнительно высокой концентрации исследуемых молекул в.растворе. Дополнительное использование многоканального цифрового анализатора позволило Жардецкому и другим [35] повысить чувствительность ЯМР-спектрометра в 20 раз. Методика обеспечила возможность исследования спектра ЯМР 0,002 М раствора НАД в D20. В спектре НАД в присутствии алкогольдегидразы происходит исчезновение пиридиновой части спектра, что является прямым указанием на определяющую роль пиридиновой части молекулы при взаимодействии НАД и фермента.
д. Применение спектроскопии ЯМР низкого разрешения
Спектроскопия ЯМР низкого разрешения дает ценную информацию о строении молекул в твердой фазе, позволяя определить положение протона и других ядер, а также исследовать релаксационные процессы, подвижность молекулы и отдельных ее частей.
Основными характеристиками линии ЯМР в спектроскопии низкого разрешения являются ширина сигнала, его моменты, форма линии, наличие тонкой структуры.
Под формой линии подразумевается математический закон, описывающий кривую интенсивности поглощения. Гауссова форма линии характерна при дипольном взаимодействии ядер-ных моментов, так как величина локальных полей распределяется согласно вероятностному закону Гаусса. Лоренцева форма возникает при наличии интенсивного движения в результате сильного обменного взаимодействия.
Функции гауссовой и лоренцевой формы описываются соответственно выражениями
(Я-Я„)»
/ -Je
J Г — J ос >
/ —________Ь._____
л j, (h-w
д Hi
и определяются значениями максимальной интенсивности /0 и пара* метрами АЯг и АЯЛ, связанными с полушириной линии соотношениями
АЯГ - —АЯ.Л, АЯЛ= I АЯ./2,
I In I I
а с шириной линии между точками максимального наклона 6Я соот* ношениями
АЯГ = ?Цн, АЯл=-^бЯ.
2 2 ¦
Ширина линии твердых тел и полимеров обычно лежит в области между 30 и 0,1 гаусса [36]. Такая ширина почти всецело обусловлена прямым ядерным диполь-дипольным взаимодействием. Так как площадь сигнала ЯМР пропорциональна числу протонов, то большая ширина линии соответствует очень малой интенсивности. Поэтому для регистрации широких линий ЯМР поле Я0 модулируется звуковой частотой сом с амплитудой Ям С Шу2. R результате модуляции возникает сигнал с частотой сом, амплитуда которого пропорциональна производной кривой поглощения (рис. 12). Это дает возможность применить узкополосный усилитель, что значительно увеличивает отношение сигнала к шумам. На выходе этот сигнал подвергается синхронному (фазовому) детектированию, постоянная времени интегрирующей i^C-цепочки обычно составляет от 1 до 10 сек.
Аппаратурные искажения. Как легко видеть, при записи производной сигнал пропорционален амплитуде модуляции. При слишком большом увеличении Яц происходит искажение формы линии,
поэтому необходимо соблюдать правило Ям < — 6Я, Конечная вели*
чина амплитуды модуляции приводит к тому, что вычисленный из данных опыта второй момент несколько превышает истинную величину АЯг. В действительности второй момент меньше экспериментального
