Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
20 мкл биотинилированного олигонуклеотида D17Z1 (5' -биотин-TAGAAGCATTCT
CAGAAACTACTTTGTGATGATTGCATTC-3’). Инкубировать на водяной бане-шейкер при +50°С (±1°С) при 50-60 об/мин. в течение 20 мин. (±2 мин.). После инкубации раствор слить.
18. В течение нескольких секунд промыть мембрану 100 мл, предварительно нагретым до +50°С Отмывающим раствором. Раствор слить.
19. Добавить 30 мл предварительно нагретого Отмывающего раствора и 180 мкл конъюгата (Пероксидаза хрена — стрептавидин). Инкубировать на водяной бане-шейкер при + 50°С (±1°С) при 50-60 об/мин. в течение 10 минут (±1 мин.). После инкубации раствор слить.
20. В течение 1 минуты промыть мембрану 100 мл, предварительно нагретым Отмывающим раствором на орбитальном шей-кере (100-125 об/мин.) при комнатной температуре. Отмывку повторить еще раз.
21. Добавить 100 мл предварительно нагретого Отмывающего раствора. Инкубировать на орбитальном шейкере (100-125 об/мин.) в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации раствор слить.
22. Мембрану промыть в течение 5 секунд 100 мл Цитратного буфера.
Колориметрическая детекция
23. Приготовить Проявляющий раствор: к 30 мл Цитратного буфера добавить 1,5 мл раствора ТМВ и 3& мкл 3% перекиси водорода. Проявляющий раствор необходимо готовить не более чем за 10 минут до использования.
24. Внести Проявляющий раствор в ёмкость с мембраной.
25. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20-30 минут на орбитальном шейкере (50-60 об/мин.) в темноте. Проявляющий раствор слить.
26. Остановить развитие окраски промывкой мембраны в деионизованной воде (100 мл). Инкубировать 5-10 минут на орбитальном шейкере (50-60 об/мин.).
27. Отмывку водой повторить дважды.
28. Для фотографирования поместить мембрану на гладкую, не адсорбирующую поверхность. Для обеспечения четкого изображения мембрана в процессе фотографирования должна оставаться влажной.
Интерпретация результатов
29. Количество ДНК в каждом образце определяют путем сравнения интенсивности окраски с интенсивностью окраски стандартов в двух колонках (рис. 23). Интенсивность окраски отражает общее количество ДНК в мембранном пятне. Записать полученные результаты.
rig
10 ШШ ¦ 1
LoBPA3EU1
5 г >> I
2.5 * * [.ОБРАЗЕЦ 2
1.2 ^ 'V •, ^ I
’у л
$ '
0.6 А.
0.3 * 1 j V/ ”
* , ¦ ' -е
. * n*. .-г .
-у -V.
' ' t
г . А.
'* 1
0.15 ; ^ %. У
¦ '< . ¦ •••
.. /¦*
Рисунок 23. Определение количества ДНК путем сравнения с интенсивностью окраски стандартных образцов ДНК. Колонка 1 представлена Quan-tiBlot ДНК-стандартами в различных разведениях (количество нг в 5 мкл). Колонка 2 представлена двумя опытными образцами в двух параллелях. Образец 1 = 1,2 нг/5 мкл или 0,24 нг/мкл, Образец
2 - 2,5 нг/2 мкл или 1,25 нг/мкл.
30. Определить концентрацию ДНК в исследуемых образцах, для этого необходимо разделить рассчитанное количество на объем внесенной ДНК в пробирку с Покрывающим раствором.
31. Если интенсивность пятна превышает ин-'«.нсивность окраски самой высокой кон-
'нции стандарта (10,0 нг), то иссле-
дуемый раствор ДНК необходимо разбавить деионизованной водой.
ДНК различных видов приматов могут также взаимодействовать с праймером (5'-TAGAAGCA
TTCTCAGAAACTACTTTGTGATGATTGCATTC-3'),
интенсивность пятен при этом может быть эквивалентна человеческой ДНК. ДНК других видов (не приматов) практически не взаимодействует с биотинилированным олигонуклеотидом. Сотрудники лаборатории Roche Molecular Systems показали, что ДНК, выделенная из различных организмов, таких как кишечная палочка, дрожжи, собака, кошка, мышь, крыса, свинья, корова, курица, индейка и рыба, даже в количестве 30-300 нг, практически не дает перекрестной гибридизации с геномной ДНК человека с помощью тест-набора QuantiBlot® Human DNA Quantitation.
25. Оценка качества ДНК при помощи электрофореза в агарозном геле
ПРИНЦИП:
Для предварительной оценки степени деградации ДНК проводят ее электрофорез в агарозном геле. Молекулы ДНК представляют собой полианионы, которые в электрическом поле движутся к аноду. ДНК (одно- и двухцепочеч-
ные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные, поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорциональна их длине.
Т *
После разделения фракции ДНК визуализируют по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия.
ОБРАЗЕЦ:
