Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
2. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.
3. Красители-интеркаляторы, такие, как бромистый этидий и Hoechst 33258, являются потенциальными мутагенами (канцерогенами). Работа с ними должна проводиться только в резиновых перчатках и маске.
4. Фенол обладает токсическим действием, поэтому процедуру фенольной экстракции необходимо проводить только в вытяжном шкафу.
5. Сливать органические отходы необходимо только в соответствующие емкости.
6. Органические отходы, содержащие гуанидин-тиоционата, сливают в сосуд с 10 М NaOH
(не допускать разбавления щелочи ниже 0,3 М), тем самым нейтрализуя HCN, образующуюся при контакте гуанидинтиоционата с кислотами.
7. Запрещается снимать крышку с электрофоретической камеры, если она подключена к источнику питания, так как высокое напряжение опасно для жизни.
8. Для предотвращения контаминации зоны, где проводятся работы по выделению ДНК и анализу продуктов амплификации, должны быть физически изолированы друг от друга, и желательно, размещаться в разных помещениях.
9. Всё лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда и др., а также рабочие растворы, должны быть строго адресными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое.
10. Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофореза.
11. Химическая посуда и оборудование, которые используются для экстракции ДНК, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.
_ ¦
12. Процедуру экстракции ДНК необходимо проводить, как минимум, с одной холостой пробой.
13. Необходимо убедиться, что используемые реактивы соответствуют необходимой степени чистоты.
14. Вместо NaOCl можно использовать другие
соединения, содержащие активный хлор, например, дветретиосновную соль гипохлорита кальция (ДТСГК), представляющего собой смесь нескольких соединений: гипохлорит
кальция (56%), гидроксид кальция (24%), хлористый кальций (8%), карбонат кальция (10%), вода кристаллизационная (2%). ДТСГК достаточно устойчива при хранении, обладает более высокой активностью, чем хлорная известь. Оказывает сильное коррозирующее действие на металлы, обесцвечивает и разрушает ткань, раздражает кожу, органы дыхания.
ОБОРУДОВАНИЕ, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ ДНК
1. Микроцентрифуга (скорость вращения - не менее 10000 об/мин.).
2. Центрифуга для 15 мл пробирок типа Costar.
3. Холодильник/морозильник ( + 2 — 8°С/ -20°С).
4. Морозильная камера ( —70°С).
5. Вытяжной шкаф.
6. Дистиллятор и устройство для деионизации воды (либо бидистиллятор).
7. Источник питания постоянного тока (до 250 В).
8. Камера для горизонтального электрофореза.
9. Ламинар или ПЦР-бокс.
10. УФ-трансиллюминатор.
11. рН-метр.
12. Бактерицидная УФ лампа.
13. Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания) .
14. Автоклав.
15. Фотоаппарат (с красным, желтым или оранжевым светофильтром) со штативом или цифровая видеокамера.
16. Компьютер.
17. Дозаторы с меняющимся объемом: 0,5-
10 мкл, 5-40 мкл, 40-200 мкл, 200-1000 мкл, 1000-5000 мкл и наконечники к ним.
18. Пластиковые пробирки с крышками объемом 1,5 мл типа Эппендорф, 15 мл и 50 мл типа Costar.
19. Штативы для пробирок и микропробирок.
20. Устройство для концентрирования и очистки ДНК (Centricon-100).
21. Магнитная мешалка с подогревом.
22. Прецизионные весы.
23. Аналитические весы.
24. FTA-карта для сбора крови.
25. Пробойник бумаги диаметром 2,8 мм или диаметром 1,8 мм.
26. Нейлоновая мембрана Biodyne®В, 0,45 мкм.
27. Емкость для гибридизации.
28. Водяная баня-шейкер.
29. Термометр.
30. Орбитальный шейкерный аппарат.
31. Аппарат для блоттинга (Слот-блот или Дот-блот).
32. Ваккуумный насос.
33. Таймер на 60 минут (±1 мин.).
34. Емкости для отходов.
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ ДНК
1. Триоксиметиламинометан (Tris).
2. Динатриевая соль этилендиаминтетрауксус-ной кислоты (Ыа2ЭДТАх2Н20).
3. Соляная кислота (НС1).
4. Натрия гидроокись (NaOH).
5. Натрия хлорид (NaCl).
6. Додецилсульфат натрия (SDS).
7. Дитиотрейтол (DTT).
8. Протеиназа К.
9. Фенол.
10. Хлороформ.
11. 8-оксихинолин.
12. Спирт этиловый (ректификат).
13. Chelex 100.
14. FTA-реагент
15. Борная кислота.
16. Дигидрат трехзамещенного цитрата натрия
(Na3C6H507X2H20).
17. Моногидрат лимонной кислоты (С6Н807ХН20).
18. Моногидрат однозамещенного фосфата натрия (NaH2P04XH20).
19. Гуанинизотиоционат.
20. Тритон Х100.
21. Двуокись кремния (0,5-10 микрон).
22. Агароза.
23. Бромфеноловый синий.
24. Ксиленцианол.
25. Глицерин.
26. Бромистый этидий.
27. Маркеры молекулярных масс фрагментов ДНК.
28. Краситель Hoechst 33258.
29. Перекись водорода.
* ;
30. ЗгЗ’г5г5'-тетраметилбензидин (ТМВ).
31. Бромтимоловый синий.
32. Дистиллированная и деионизованная вода.
