Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
4. К пробе добавить 15 мкл суспензии сорбента InViSorb 50™ и кратко встряхнуть на вортексе. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут.
ВНИМАНИЕ: перед использованием суспензию сорбента InViSorb 50™ тщательно встряхнуть.
5. Центрифугировать при 10000 об/мин.
1 секунду. Супернатант осторожно отделить от осадка сорбента.
6. Добавить 1 мл охлажденного ( —20°С) бу-
фера для очистки. Ресуспендировать осадок на ДО ДЕКАТОРЕ (мощном вортексе) в течение 20 секунд. Центрифугировать при 10000 об/мин. 1 секунду. Супернатант осторожно отделить от осадка сорбента.
7. Повторить п. 6 дважды.
8. Инкубировать открытые пробирки при 60°С в течение 3 минут.
9. К осадку сорбента с ДНК добавить 60-80 мкл предварительно нагретого (70°С) буфера для элюции. Ресуспендировать на ДОДЕКАТОРЕ (мощном вортексе) в течение 20 секунд. Инкубировать при 70°С в течение 2 минут. Ресуспендировать на ДОДЕКАТОРЕ (мощном вортексе) 20 секунд. Инкубировать при 70°С в течение 5 минут.
10. Центрифугировать при 10000 об/мин. в течение 2 минут.
11. Перенести ДНК-экстракт в чистую пробирку. Подписать.
ВНИМАНИЕ: отбирать супернатант следует осторожно, не задевая осадка сорбента InViSorb 50™.
12. Рекомендуется п. 11 повторить еще раз.
19. Концентрирование и очистка экстрактов
ДНК при помощи устройства
«Centricon 100»
ПРИНЦИП:
Концентрирование достигается путем ульт-
рафилътрации раствора ДНК через анизотропную мембрану. Под действием центробежной силы растворитель и низкомолекулярные вещества (в случае использования Centricon 100 — меньше 100 кДа) проходят через мембрану и собираются в емкости для сбора фильтрата, тогда как молекулы ДНК не проходят через мембрану и концентрируются в растворе.
Концентрирование с помощью Centricon 100 рекомендуется проводить для образцов, содержащих меньше, чем 500 нг ДНК (например, в случае выделения из 10 мкл крови). Концентрирование образцов с большим содержанием ДНК можно проводить этанольной преципитацией.
ОБРАЗЕЦ:
Водный раствор ДНК без примесей фенола, хлороформа и бутанола, способных повредить мембрану Centricon 100.
1. Собрать концентратор «Centricon 100», как показано на рисунке 16. Подписать. Во избежание контаминации устройство Centricon 100 необходимо собирать в ПЦР-камере или в ламинаре.
2. Не касаясь наконечником автоматической пипетки мембраны, внести в верхний резервуар 2 мл экстракта ДНК (в случае экстракции из костной ткани) или 1,5 мл ТЕ-буфера и около 500 мкл экстракта ДНК (в случае выделения ДНК из волоса, ногтя,
мягких тканей и др.). Верхний резервуар закрывают пробиркой для сбора концентрированного раствора ДНК (рис. 16) или парафильмом и, не касаясь раствора, прокалывают парафильм в нескольких местах тонкой стерильной иглой.
Рисунок 16. Подготовка Centricon 100 для концентрирования раствора ДНК
3. Центрифугируют при 1000 д. Параметр д
вычисляется по формуле:
где R (см) — радиус от центра ротора до точ-
ки, в которой необходимо вычислить g, N
(об/мин.) — скорость вращения ротора.
Емкость для ссора 1 концентрированного I раствора ДНК
Резервуар для внесения концентрируемого раствора ДНК
Мембрано-
держатель
Мембрана
Концент ри рое энный раствор ДНК
Емкость для фильтрата
Центробежная сила
Фильтрат
g = 1118 • 10'8 • R • N2
Нельзя центрифугировать со скоростью более 1000 д, во избежание повреждения мембраны «Centricon 100». Время центрифугирования подбирают опытным путем так, чтобы ДНК сконцентрировалась в объеме 4-6 мкл, обычно не более 30 минут, при комнатной температуре. После центрифугирования содержимое нижнего резервуара удаляют.
4. В верхний резервуар колонки к концентрированному раствору ДНК повторно добавляют 2 мл ТЕ-буфера и дважды повторяют процедуру 2 и 3.
5. Сконцентрированный раствор ДНК переносят в специальную пробирку, которую присоединяют к колонке верхнего резервуара и переворачивают полученную конструкцию, как показано на рисунке 17.
Коцент рированный
Образец ДНК
Фильтрат
Центробежная сила
Рисунок 17. Получение концентрированного
раствора ДНК.
6. Центрифугируют при 1000 g в течение 2 минут при комнатной температуре.
7. В пробирке собирается концентрированный раствор ДНК (рис. 18).
8. Оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи электрофореза в
0,8-1% агарозном геле. Записать полученный результат.
9. Выделенную ДНК хранить при +4°С в течение 3-х недель, либо при — 70°С неограниченно долго.
Емкость для ссора концентрированного раствора ДНК
/
Фильтрат
\
\
Крьшка
IP*
Коцент рированный образец ДНК
Емкость а ля фильтрата
I
f: