Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел - Корниенко И.В.
ISBN 5-7509-0904-2
Скачать (прямая ссылка):
7. Инкубировать 12-14 часов при + 56°С.
8. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
9. Пробы инкубировать в кипящей водяной бане или в термостате с ячейками при температуре 100 °С в течение 8 минут.
10. Перемешать на вортексе в течение 5-10 секунд.
11. Центрифугировать в течение 2-3 минут при 10000 - 15000 об/мин.
12. Для постановки ПЦР используют супернатант. ДНК, очищенная с помощью Chelex 100, является одноцепочечной, поэтому оценить количество и качество выделенной ДНК при помощи методов, где используются интеркалирующие красители, например, бромистый этидий нельзя.
13. Остатки супернатанта хранят при температуре 2-8°С или при -70°С (длительное хранение).
14. При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.
18. Экстракция ДНК из различных биологических источников с помощью набора
PROTRANS Forensic Kit I
ПРИНЦИП:
С помощью системы PROTRANS Forensic Kit I можно получить большое количество высоко-очищенной ДНК. Экстракция включает в себя лизис клеток хаотропными компонентами набора с последующего связыванием ДНК сорбентом InViSorb 50™ на основе кремнезема (silica matrix), обладающий высокой аффинностью к нуклеиновым кислотам. Процедура выделения состоит из нескольких этапов и является оптимальной для быстрой экстракции ДНК одновременно из нескольких образцов.
ОБРАЗЕЦ:
Цельная кровь, пятна крови, волосы, мягкие ткани, клетки букального эпителия.
1. В состав набора, помимо суспензии сорбента InViSorb 50™, входят также буфер для лизиса клеток, концетрат буфера для очистки связанной ДНК, и буфер для элюции ДНК (трис-HCl, ЭДТА). Для работы из концентрата приготовить буфер для очистки, для этого: к концетрированному буферу добавить 75 мл деионизованной воды и 210 96% этанола и полученный раствор тщательно перемешать. Хранить при температуре — 20°С.
2. Подготовка проб для выделения ДНК зависит от вида биологического объекта. Ниже представлены различные варианты первого этапа экстракции ДНК.
Материал Варианты первого этапа
экстракции ДНК
Цельная В микроцентрифужную пробир 3 мин.
кровь с ан ку объемом 1,5 мл добавить 1 мл 30 сек.
тикоагулян деионизованной воды и 0,5 мл
том крови, перемешать.
Инкубировать при комнатной
температуре.
Центрифугировать при 10000
об/мин.
Осторожно удалить супернатант.
Осадок лейкоцитов дважды про
мыть 1 мл деионизованной водой.
Материал Варианты первого этапа
экстракции ДНК
Добавить 1 мл лизирующего бу 10 мин.
фера и инкубировать на ДОДЕ-
КАТОРЕ (мощный вортекс).
Свернув Перенести приблизительно 30 сек.
шаяся 300 мкл свернувшейся крови в 3 мин.
кровь 1,5 мл пробирку и добавить 200 30 сек.
4 мкл 0,9% раствора NaCl. 20 мин.
Ресуспендировать на ДОДЕКА-
ТОРЕ (мощный вортекс).
Добавить 1 мл деионизованной
воды и инкубировать при ком
натной температуре.
Центрифугировать при 10000
об/мин.
Осторожно удалить супернатант
Осадок лейкоцитов дважды про
мыть 1 мл деионизованной водой.
Добавить 1 мл лизирующего бу
фера и инкубировать на ДО ДЕ
КАТОРЕ (мощный вортекс).
Пятно Перенести носитель с пятном 2 ч.
крови крови в пробирку на 1,5 мл.
Добавить 1 мл лизирующего бу
фера и инкубировать на ДОДЕ-
КАТОРЕ (мощный вортекс).
Материал Варианты первого этапа
экстракции ДНК
Центрифугировать при 10000 30 сек.
об/мин.
Супернатант осторожно перене
сти в чистую 1,5 мл пробирку.
Мягкие Перенести примерно 0,5-20 мг >1 ч.
ткани свежей или замороженной мяг
кой ткани в 1,5 мл реакционную
пробирку.
Соединительные ткани должны
быть предварительно измельче
ны с помощью жидкого азота.
Добавить 1 мл лизирующего бу
фера и инкубировать на термо-
шейкере при 50°С.
3. Перед выполнением дальнейших операций с лизатом буфер для очистки необходимо охладить до — 20°С, буфер для элюции подогреть до + 70°С.
