Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Второй новый метод требует применения техники рекомбинантных ДНК и клонированных зондов ДНК для идентификации и количественной оценки аллельного полиморфизма. К настоящему времени выявлено более 100 полиморфных генов в геноме человека и установлена их хромосомная локализация; банк этих данных быстро увеличивается. Они оказываются чрезвычайно удобными маркерами, даже если эти гены не экспрессируются в структурные или ферментативно-активные белки. Скрининг этих маркеров с помощью блоттинга по Саузерну в настоящее время используется, хотя и в небольших масштабах, при идентификации клеточных линий [32].
Можно надеяться, что в течение ближайшего десятилетия использование одного или обоих этих методов приведет к- однозначному типированию всех наиболее широко используемых клеточных линий.
4.4. Идентификация тканей, из которых получены линии клеток
Маркеры, используемые для выявления тканей, служивших источниками линий клеток, по-видимому, столь же многочисленны, как и типы клеток многоклеточных организмов. Главные средства включают в себя анализ тонкой структуры, иммунохи-мические тесты на цитоскелетные и тканеспецифические белки
и, конечно, любые испытания из широкого спектра биохимических тестов на специфические функциональные свойства клеток разных тканей. Ниже приводятся некоторые наиболее общие методы, относящиеся к этой категории.
4.4.1. Тонкий структурный анализ для выявления характеристических маркеров
Присутствие десмосом или кератиновых филаментов, выявляемых с помощью электронного микроскопа, принято считать свойством эпителиальных клеток. Так называемые тельца Вей-беля — Палада специфичны для клеток эндотелия из пупочной вены и других источников. Клеши островков Лангерганса могут быть морфологически охарактеризованы присутствием в них специфических секреторных гранул.
Ниже приведены основные этапы подготовки культивируемых клеток для проведения такого тонкого структурного анализа. Список необходимых реагентов приведен в табл. 4.11. Подготовка клеточного монослоя или осадка клеток, отобранных из суспензионной культуры или диссоциацией монослоя, проводится в следующем порядке.
I. Соберите клетки центрифугированием (не более 1—3-•106 клеток) в стеклянных или полипропиленовых пробирках объемом 15 мл. Подготовка клеток монослоя для анализа может производиться непосредственно в культуральной пластиковой посуде.
II. Слейте культуральную среду и промойте клетки исходным буфером при 4°С. Все последующие операции вплоть до (V) должны проводиться при этой температуре.
III. Фиксируйте клетки в течение 1 ч 2%-ным забуференным глутаровым альдегидом. При фиксации отделите осадок клеток от дна пробирки с помощью стеклянной палочки для облегчения диффузии фиксатора со всей поверхности осадка. Важно сохранять клетки в плотном осадке, не давая им диссоциировать. Такие крупные конгломераты клеток будут осаждаться в более вязких жидкостях, используемых на последующих стадиях.
IV. Слейте фиксатор и трижды промойте фиксированный материал буфером. Продолжительность каждой промывки не менее 10 мин.
Ю*
Таблица 4.11. Реагенты1*, используемые при подготовке культивируемых клеток к электронной микроскопии
Исходные растворы
1. Na-какодилатный буфер 0,1 М pH 7,2—7,3
Какодилат натрия 42,8 мг
Феноловый красный — 0,5%-ный водный раствор 4 мл
Растворите в 1 л бидистиллнрованной воды и доведите pH с помощью 1 М НС!
2. Глутаровый альдегид — 8%-ный водный раствор Разведите 1 :2 бидистиллнрованной водой
3. Четырехокись осмия — 4%-ный водный раствор
4. Урапнлацетат — 0,5%-ный водный раствор
5. Цитрат свинца по Рейнольдсу
Нитрат свинца 1,33 г
Цитрат натрия (2Н2ОХ) 1,76 г
Бидистилдированная вода 30 мл
Растворяйте при помешивании в течение 30 мин. Добавьте 8 мл свободного от карбонатов 1 М NaOH и доведите БВ до 50 мл Растворы, стабильные не менее 6 мес, следует перед употреблением пропускать через миллипоровый фильтр (диаметр пор 0,22 мкм и менее) для удаления возможного тонкого осадка
6. Набор спиртов вплоть до 100% (абсолютный) и пропилеиоксид
7. Смолы для заключения
А. Эпон 812 62 мл
Додеценилянтарный ангидрид (ДЯА) 100 мл
Б. Эпон 812 100 мл
Метилнадиновый ангидрид (МНА) 89 мл
Растворы можно приготовить заранее и хранить в плотно закрытых контейнерах при 4 °С в течение по крайней мере 6 мес
Катализатор (2,4,6-три диметил-аминометил фенол) (ДМР 30) следует добавлять непосредственно перед использованием до концентрации 1,5—2%
Рабочие растворы
1. Забуференный глютаровый альдегид (2%): концеитрированвый буфер
и 4%-ный раствор глютарового альдегида смешиваются в соотношении 1 : 1
