Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Глюкозо-1-фосфат с 1% глюкозо-
1,6-дифосфат, (200 мг)
MgCl, (25 мг)
ФМС (3 мг)
МТДТ (10 мг)
ГФД (100 ед/мл), (100 мкл)
ФГД ТЭБ ТЭБ (0.1Х) Н20 (35 мл)
0,5 М трис pH 7,0 (15 мл)
6-Фосфоглюконат натрия (200 мг)
NADP (20 мг)
ФМС (3 мг)
МТДТ (10 мг)
1) Разделение во всех гелях проходит в течение 16—18 ч при 4°С и градиенте напряжения 4—5 В/см (160—180 В), NADP (5 мл 0,005 М раствора) добавляется к катодному буферу и ко всем окрашивающим растворам во всех случаях, когда определяется NADP-дегидрогеназа. Более подробно о проведении анализа см. табл. 4.4 и относящийся к ней текст. Для всех ферментов, за исключением ЭС-D, окрашивающие растворы смешиваются непосредственно перед использованием с равным объемом 2%-ного агара в воде. Смесь нагревается для большей гомогенности и перед нанесением охлаждается до 45—50 °С. При анализе ЭС-D на гель накладывается фильтровальная бумага, на которую и наносится окрашивающий раствор. В последнем случае положение аллознмов выявляется путем удаления фильтровальной бумаги после инкубации и просмотра геля под длинноволновым ультрафиолетовым светом. Полосы появляются в промежутке времени от 10 мин до 3 ч в зависимости от типа клеток и аллофермента, а также от количества использованных для гомогенизации клеток.
+¦
• ФГД _0 + АДА
ПЕП-D
= Ё = =
А С А-С
1 1,2 2 1,3 3
+
ФГМ
ФГМ,
д 2 1 1,2
яш
Ш ™
щ) иш ив ¦ ЯИ
¦ Ш ¦ "В
10 минут 45 минут
ЭС-D
1 1,2 2
- 1
1,2
Рис. 4.7. Зимограммы, показывающие фенотипы шести полиморфных ферментов линий клеток человека. ФГД — 6-фосфоглюконатдегидрогеназа; ПЕП-D — пептидаза D; АДА — аденозиндезаминаза; ЭС-D — эстераза D; ФГМ.1, з — фосфоглюкомутазы 1 и 3. В каждом случае показано положение старта (0), а названия наиболее распространенных фенотипов приведены на оси абсцисс. В ряде случаев показаны множественные полосы аллоферментов, но иногда они мигрируют так близко, что сливаются, образуя единую, более широкую полосу. Зимограммы ФГМ приведены на одном н том же геле, но после различного времени инкубации, поскольку для выявления ФГМ3 требуется большее время. Изофермент ФГМг выявляется после промежуточного времени инкубации, что затрудняет анализ ФГМЬ
фенотипов в популяции здоровых людей (табл. 4.10). Так, например, линия клеток с генетической структурой АДА-1, ГФД-В, ЭС-D-l, ФГМ1-2, ФГМ3-1 и ФГД-А, полученная от белого мужчины, будет характеризоваться частотой фенотипа 0,8845Х X 1,0X0,8131X0,9780X0,0558X0,5403X0,9536 = 0,0202. Полученное значение отражает вероятность встречи линии клеток с указанной выше генетической структурой и может оказаться 'информативным, если возникнет вопрос о взаимозагрязнепии линий [20, 22].
Способность этого метода различать клеточные линии увеличивается при определении электрофоретических профилей дополнительных аллозимов. К числу наиболее часто используемых для этой цели относятся кислая фосфатаза (КФ1), глиок-салаза 1 (Г01), малатдегидрогеназа (МД), а-фукозидаза
(а- Ф) и аденилаткиназа (АК1) [22,24].
Таблица 4.10. Частота фенотипов семи полиморфных ферментов в популяциях белых н чернокожих людей1)
Фермент Фенотип Частота фенотипа
Белые Чернокожно
АДА 1 0,8845 0,9320
1---2 0,1138 0,0668
2 0,0017 0,0012
ГФД А 0 0,4400
В2> 1 0,5600
ЭС-D 1 0,8131 0,8039
1-2 0,1776 0,1961
2 0,0092 0,0096
ПЕП-D 1 0,9780 0,9110
1---2 0,0220 0,0479
1---3 0,0000 0 0411
2 0,0001 0,0006
3 0,0000 0,0005
ФГМ! 1 0,5849 0,6019
1---2 0,3565 0,3204
2 0,0558 0,0485
ФГМз 1 0,5403 0,1362
1---2 0,3997 0,4085
2 0,0600 0,4553
ФГД А 0,9536 0,9264
АС 0,0455 0,0727
С 0,0009 0,0009
') По данным работы [22].
2) Данные только по мужчинам: маркер сцеплен с Х-хромосомой.
Полиморфные изоферменты описаны также для линий мышиных клеток и для гибридов. Для выявления межвидового взаимозагрязнения в этих случаях можно использовать анализ аллоферментов эстеразы (ЭС-1 и ЭС-2), дипептидазы 1 (ДП-1), глутамат-оксалоацетат — трансаминазы 2 (ГОТ-2), изоцитратде-гидрогеназы 1 (NADP-зависимая), малатдегидрогеназы (ADP-зависимая; цитозольная форма), глюкозофосфатизомеразы 1 (ГФИ-1) и фосфоглюкомутаз 1 и 2 (ФГМ1 и ФГМ2). И хотя методология электрофоретического разделения и этих аллофер-|ментов достаточно разработана [25], частоты их распространения изучены недостаточно, чтобы служить маркерами специфических линий клеток мыши.
