Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
С
Флакон
У
Вращающаяся Бутыль
">П ^
Спираль Керамика Стеклянные Лиски
?> «±ь"0| трувни
1
О ЧД-0
rei
Пластиковая
Пластинчатый теплообменник Многопластинчатый пленна
БЛОК
¦
¦
t t
Микроносители
Стопа пластин Стеклянные Бусы
и-
Полые волокна
Увеличение
масштаба
Мультикультураль-ные системы
Унитарные
системы
Рис. 3.6. Увеличение масштаба культуральных систем для клеток, зависящих от субстрата.
получение единичных систем гомогенных клеток с огромными возможностями увеличения масштаба. Однако такие системы можно пытаться применять только в том случае, если имеется достаточно времени и средств для обеспечения длительного периода развития культуры.
Итак, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения увеличения выхода клеток. Монослой-ные культуры, однако, также обладают рядом преимуществ,
а) Очень легко провести полную замену среды и промыть пласт клеток перед добавлением свежей среды. Это особенно важно в тех случаях, когда рост клеток проводится в одних экспериментальных условиях, а наработка продукта — в других условиях, в частности при переносе . клеток из среды с сывороткой в бессывороточные условия.
Эффективность смены среды в монослойных культурах такова, что позволяет достигать полного удаления нежелательных компонентов.
б) Если нужны искусственно высокие плотности клеток, то это может быть достигнуто с помощью использования пер-фузионной техники. Монослойные культуры сильно облегчают применение перфузионных систем, поскольку в этом случае отпадает необходимость использования тонких систем фильтрации для удержания клеток.
в) У многих клеток экспрессия требуемого продукта происходит значительно эффективнее, если клетки прикреплены К субстрату.
г) Одна и та же аппаратура может быть использована с разным отношением среда/клетки, которое, естественно, может легко изменяться в ходе эксперимента.
д) Монослойные культуры обеспечивают наибольшую гибкость исследований, поскольку они могут быть использованы для любого типа клеток. Если нужно использовать несколько типов клеток, то, не задумываясь, следует выбирать монослойную культуру.
Следует отметить, что система с микроносителями обладает преимуществами г), д) и отчасти б) по сравнению с суспензионной культурой. У монослойной культуры по сравнению с суспензионной можно отметить четыре главных недостатка.
а) Трудоемка и дорога при увеличении масштаба.
б) Требует значительно больше пространства.
в) Невозможно с достаточной эффективностью прослеживать рост клеток, поскольку трудно отбирать пробы и подсчитывать клетки.
г) Более сложно определять и контролировать такие параметры, как pH и 02, и обеспечивать гомогенность клеток.
Во всех случаях использование микроносителей исправляет эти недостатки монослойной культуры.
3.2. Прикрепление клеток
Поверхности клеток животных и поверхности традиционных культуральных сосудов из стекла и пластика несут отрицательные заряды. Поэтому для прикрепления клеток необходимо образование поперечных сшивок с гликопротеинами, а также присутствие двухвалентных катионов Са2+, Mg2+. Наиболее изученным из таких гликопротеинов является фибронектин. Он имеет молекулярную массу 220000 дальтон, синтезируется многими клетками и присутствует в сыворотке и других физиологических жидкостях. И хотя клетки могут, по-видимому, прикрепляться за счет одних только электростатических взаимодействий, было показано, что механизм прикрепления оказывается
одним и тем же при всех зарядах субстрата [7]. Важным фактором является суммарный отрицательный заряд, и субстраты, обладающие высокой поверхностной энергией (стекло и пластик), оказываются весьма удобными для прикрепления клеток. Органические поверхности должны быть смачиваемыми и отрицательно заряженными; это может достигаться как химической обработкой (например, окисляющими агентами, сильными кислотами), так и в результате физических воздействий (высоковольтный разряд, облучение ультрафиолетовым светом, бомбардировка электронами высоких энергий). Эти методы используются фирмами, поставляющими пластиковую посуду для культур. В результате таких обработок увеличивается общий отрицательный заряд поверхности (например, за счет образования отрицательно заряженных карбоксильных групп), что облегчает электростатическое прикрепление клеток. Поверхность культурального сосуда может быть также покрыта веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто используемыми для этого агентами являются коллаген и полиаминокислоты. Можно использовать продажные препараты коллагена для культуры ткани (Витроген 100, Flow Laboratories), что позволит избежать утомительной процедуры получения коллагена из крысиных хвостов. Успешное применение коллагена в качестве ростовой поверхности было продемонстрировано также при выращивании клеток на покрытых коллагеном микроносителях (Цитодекс-3, Pharmacia Fine Chemicals).
