Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
По мере того как культуральные системы становятся более крупными и сложными, увеличивается и необходимость соединений различных блоков системы. Для таких соединений можно использовать комбинации трубок из силикона и нержавеющей стали. Силиконовые трубки обычно проницаемы для газов, что может стать источником проблем при использовании их для перекачки сред вследствие потери растворенного С02. Они также подвержены быстрому износу при использовании в перистальтических насосах. Следует использовать толстостенные трубки с дополнительными усиливающими элементами (втулками) . При соединении силиконовых трубок с трубками из нержавеющей стали закрепляйте участки соединения пластиковыми скобами для предотвращения разъединения в системе в процессе работы. Используйте силиконовые наконечники на концах трубок из нержавеющей стали, чтобы не поцарапать культуральные сосуды и избежать механического повреждения клеток.
2.2.3. Соединения
Часто возникает необходимость соединять несколько сосудов системы в ходе культивирования или же собирать систему после автоклавирования отдельных блоков. Соединение должно осуществляться в стерильных условиях, так что приобретение специализированных соединительных коннекторов, хотя и требует определенных затрат, но полностью себя оправдывает (например, линии, поставляемые LH Fermentation).
2.2.4. Отбор сред или клеточных суспензий
Необходимым условием культивирования клеток является обеспечение возможности частого и безопасного отбора проб культуры. Простейшее решение этой проблемы состоит в использовании вакциновых пробок, которые можно протыкать
иглой шприца. Этот метод, однако, пригоден только для небольших культур, и многократное протыкание может привести к нарушению стерильности культуры. Весьма удобным является использование устройств для отбора проб, таких как, например, поставляемые фирмой AVRI Pir-bright, Surrey, UK) (рис. 3.1), поскольку такие устройства обеспечивают автоматическую очистку культуры от среды, содержащей мертвые клетки и, следовательно, избавляют от необходимости предварительного отбора выбрасываемых небольших начальных проб.
2.2.5. Фильтры
Воздушные фильтры необходимы для обеспечения вхождения и выведения газов. Даже при отсутствии постоянного газообмена один входной фильтр, как правило, необходим для уравнивания давления и для введения или удаления среды. Фильтры должны быть несмачиваемыми с диаметром пор 0,22 мкм. Примерами таких фильтров могут служить Microflow 50 и Pall Ultipor.
Рис. 3.1. Устройство для отбора проб, разработанное AVRI, Pirbright и поставляемое LH Fermentation. Воздух отсасывается через А (с помощью шприца), в результате чего среда уходит из культуры через Б в маленький сосуд В. Г представляет собой фильтр из хлопковой ваты.
2.2.6. Ингредиенты среды, не утилизирующиеся клетками
I. Карбоксиметилцеллюлоза часто добавляется к среде до концентрации 0,1% для снижения механических повреждений клеток гидродинамическими силами, создаваемыми вращающимися мешалками. Соединения этого ряда лучше
растворимы, чем метилцеллюлоза, и обладают лучшей растворимостью при 4°С, чем при 37 °С.
II. Плуроник F-68 (полигликоль) (BASF Wyandot Corp. Inc., USA) часто добавляется в среды до концентрации 0,1% для снижения количества пены, образующейся в культурах в результате вращения мешалки или искусственной аэрации, особенно при использовании сывороток. Препарат предотвращает прикрепление клеток к стеклу благодаря подавлению стимулирующего действия сыворотки на этот процесс.
2.3. Практические советы
I. Всегда предварительно прогревайте среду до рабочей температуры (обычно 37°С) и стабилизируйте pH до добавления среды к клеткам. Сдвиги pH на начальных стадиях культивирования могут приводить к нежелательным последствиям, включая увеличение продолжительности лаг-фазы и снижение выхода клеток.
II. Избегайте использовать в качестве инокулята клетки, находящиеся в стационарной фазе роста; это приводит к удлинению лаг-фазы и даже отсутствию роста. Идеально использовать для пересева клетки, находящиеся в конце логарифмической фазы.
III. Всегда используйте достаточно высокую плотность клеток в инокуляте. Твердо установленного правила о минимальном количестве клеток в инокуляте, ниже которого они уже не будут расти, нет. Эта величина зависит от линии используемых клеток и состава среды. И все же минимально возможный размер инокулята варьирует в пределах от 5-104 до 2-105 клеток/мл или от 5-103 до 2-104 клеток/см2.
IV. Оптимальную скорость вращения мешалки для данного типа культурального сосуда и данной линии клеток подбирайте эмпирически. Для суспензионных культур скорость вращения может меняться от 100 до 500 об/мин, но оптимальная скорость составляет 200—350 об/мин. Для культур на микроносителях скорость вращения составляет 20—100 об/мин.
V. Продуктивность культуральных систем зависит от качества и количества среды, а у клеток, зависящих от субстрата, и от площади поверхности, на которой могут расти клетки. Единица объема среды способна обеспечить ограниченный выход клеток. На величину этого выхода влияют следующие факторы: pH, ограничение доступа кислорода, накопление токсических продуктов, истощение питатель-
