Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
2.7. Кислород
Возможность увеличения масштаба культивирования клеток животных в значительной степени зависит от обеспечения культуры кислородом, не сопровождающимся повреждением клеток. Кислород растворяется в культуральной среде лишь до определенного предела (7,6 мкг/мл). Средняя скорость потребления клетками кислорода, судя по литературным данным [4], составляет 6 мкг/106 клеток/ч. Следовательно, в типичной культуре с концентрацией 2-106 клеток/мл истощение растворенного в среде кислорода (7,6 мкг/мл) произойдет менее чем за час. Необходимо, следовательно, поставлять кислород в среду в течение всего жизненного цикла культуры, и возможность адекватного решения этой проблемы зависит от скорости переноса кислорода (СПК) в системе:
СПК= К1а (С* —С), (7)
где СПК — количество переносимого 02/единица объема/единица времени; К1 — коэффициент переноса кислорода; а — площадь поверхности, через которую осуществляется перенос кислорода (поскольку эта величина может быть измерена только
в стационарных и поверхностно аэрируемых культурах, обычно используют параметр К1а, обладающий размерностью [объем/ /час] и представляющий собой коэффициент переноса массы); С* — концентрация растворенного кислорода в среде при насыщении и С — действительная концентрация кислорода в данный момент времени.
При С = 0 параметр КЛа (СПК./С*) имеет размерность ч-1
и, следовательно, может служить показателем времени, необходимого для полной оксигенации данного культурального сосуда в данных экспериментальных условиях.
Аэрация культуры может быть достигнута с помощью одного из изложенных ниже методов либо их комбинации: поверхностная аэрация, пробулькивание, диффузия через мембраны, перфузия среды, увеличение парциального давления 02, увеличение атмосферного давления.
2.7.1. Поверхностная аэргция в статических культурах
В закрытых культуральных сосудах важным фактором является количество кислорода в системе и его доступность для клеток, растущих под 3—6-миллиметровым слоем среды. Обычно в статических культурах используется отношение объема газовой фазы к объему среды 10:1. При таком соотношении
Таблица 3.1. Концентрация кислорода в газовой и жидкой фазах культуральных сосудов Ру
Кислород в 900 см3 воздуха:
900X0,21X32/22 400 = 0,27 г Кислород в 100 мл среды 100X7,6ХЮ-4 = 0,0076 г
Примечания:
0,21 = концентрация кислорода в воздухе
32 = мол. масса кислорода
22 400 = грамм-молекулярный объем
7,6X10-4 = растворимость кислорода в воде при 37 °С
при равновесии с воздухом.
культуры оказываются в достаточной степени обеспечены кислородом. Так сосуды емкостью 1 л (например, флаконы Ру) с 900 см3 воздуха и 100 см3 среды содержат первоначально
0,2776 г кислорода (табл. 3.1). Этого количества кислорода хватает для поддержания 108 клеток в течение 450 ч, что вполне достаточно. Вторым фактором является доступность этого кислорода для клеток. Скорость транспорта кислорода из воздушной фазы в водную составляет, как было подсчитано, около 17 мкг/см2/ч [4]. Этого более чем достаточно для клеток, растущих в литровом сосуде. Однако если среда у поверхности
будет насыщена кислородом, а его концентрация у монослоя клеток близка к нулю, то скорость диффузии кислорода к клеткам, согласно закону Фика, составит около 1,5 мкг/см2/ч. При такой скорости диффузии кислород обеспечивает поддержание около 50ХЮ8 клеток в литровом сосуде. Для многих исследователей, работающих с культурами клеток, такая плотность клеток вполне достаточна. Приведенные вычисления подчеркивают важность поддержания большого объема газовой фазы в статических закупоренных культурах, поскольку в ином случае кислородная недостаточность может стать одним из факторов, ограничивающим рост. Для более полного обсуждения этих вычислений, включая закон диффузии Фика, следует обратиться к обзору Спира и Гриффитса [4].
2.7.2. Поверхностная аэрация в перемешиваемых культурах
Перенос кислорода в перемешиваемых культурах зависит от скорости вращения и формы мешалки. Значение К1а определяется экспериментальным путем [4], но обычно аэрация не превышает таковую, обеспечиваемую поверхностным захватом кислорода, если скорость вращения не больше 100 оборотов/ /мин. Поскольку скорость поступления кислорода зависит главным образом от поверхности культуральной среды, при увеличении масштабов культуры важно не превышать отношения глубины среды к диаметру 2:1, если не используются более эффективные системы аэрации.
2.7.3. Пробулькиваииа
Пропускание пузырьков газа через среду является чрезвычайно эффективным средством увеличения переноса кислорода (как было показано при ферментации у бактерий). Однако этот метод может быть опасен для клеток животных вследствие повреждающего действия пузырьков на клеточные мембраны из-за высокой поверхностной энергии. Повреждающее действие может быть снижено при использовании крупных пузырьков воздуха (которые характеризуются меньшей поверхностной энергией по сравнению с мелкими пузырьками) путем снижения скорости поступления воздуха (до 5 см3/л/ч) и добавлением препарата плуроник F-68. В разд. 4.7 описан специальный метод пробулькивания (ферментер с воздушным лифтом), который может быть с успехом использован в больших одноблочных монослойных культурах (например, во флаконах с большой площадью поверхности). При использовании пробулькивания эффективность оксигенирования повышается в культуральных сосудах с высоким отношением высоты к диаметру, поскольку высокое давление у дна таких сосудов увеличивает растворимость кислорода.
