Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
3.2.1. Поверхности для прикрепления клеток
а) Стекло. Предпочтительнее использовать алюмо-боросиликат-ное стекло (например, пирекс), поскольку Na-силикатное стекло может подщелачивать среду и перед употреблением должно быть детоксифицировано путем кипячения в слабой кислоте. При повторном использовании стеклянная посуда становится менее пригодной для прикрепления клеток, но эффективность прикрепления может быть восстановлена с помощью обработки
1 мМ ацетатом магния. После нескольких часов вымачивания при комнатной температуре раствор ацетата удаляется, посуда ополаскивается дистиллированной водой и автоклавируется.
б) Пластик. Наиболее часто используемым пластиковым материалом для культуры клеток является полистирол, но можно также использовать полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и ацетат целлюлозы при условии правильной обработки этих полимеров.
в) Металлы. Для роста клеток пригодны как нержавеющая сталь, так и титан, поскольку оба вещества химически относительно инертны и обладают достаточно высоким отрицательным поверхностным зарядом. Существует много марок нержавею-
щей стали и следует выбирать такие сорта, которые не высвобождают токсические ионы металлов. Наиболее часто используется для культур марка стали 316, по пригодны также марки 321 и 304. Нержавеющая сталь должна быть промыта кислотой (смесь 10% азотной кислоты, 3,5% фтористоводородной кислоты и 86,5% воды) для удаления поверхностных загрязнений и включений, образующихся при обрезании листа.
3.3. Наращивание клеток; этап 1, вращающиеся бутыли
Для получения оптимального количества клеток в культуре необходимо обеспечить клетки максимальной поверхностью для роста, сохраняя при этом минимум объема среды и воздушной фазы. Стационарные культуры обладают только одной поверхностью, к которой могут прикрепляться клетки; следовательно, они требуют большого объема среды. Количество среды может быть снижено при помещении культуры на качалку или же чаще при использовании вращающихся цилиндрических сосудов. У вращающихся бутылей почти вся внутренняя поверхность доступна для роста клеток, хотя в каждый момент времени лишь 15—20% поверхности бутыли покрыто средой. При вращении бутыли клетки попеременно оказываются на воздухе или под средой, тогда как в стационарной культуре наблюдаются почти анаэробные условия. Этот метод культивирования позволяет снижать объем среды, но все еще требует значительной воздушной фазы для поддержания достаточного количества кислорода и нужного pH. Увеличение масштаба культуры при использовании вращающихся бутылей требует использования сосудов с минимально возможным диаметром. Поверхность роста может быть увеличена вдвое как за счет удвоения диаметра, так и за счет удвоения длины. Однако в первом случае объем среды и воздушной фазы увеличивается в 4 раза, а во втором случае — только в 2 раза.
Единственным способом увеличения продуктивности вращающихся бутылей и снижения их объема является использование перфузионной системы, впервые разработанной Крузе [8] и поставляемой New Brunswick Scientific Company и Bellco Glass Inc. (автосборщик). Это дорогостоящее оборудование, поскольку в нем использовано сложное вращающееся соединение для обеспечения подключения бутыли к перфузионной системе. Однако при использовании такой системы значительно увеличивается выход клеток и достигается экстенсивный многослойный рост.
3.3.1. Методика испопьзоввния стандартных вращающихся одноразовых культур
Приведенная ниже процедура основана па использовании пластиковых бутылей разового использования с рабочей поверхностью 1400 см2 (23X12 см), поставляемых фирмами Corning или Becton Dickinson.
I. Добавьте 300 мл ростовой среды.
II. Добавьте 1,5X10' клеток.
III. Вращайте бутыль со скоростью 12 об/ч при 37°С в течение 2 ч для обеспечения равномерного распределения клеток на фазе прикрепления.
IV. Снижайте скорость вращения до 5 об/ч и продолжайте инкубацию.
V. Исследуйте клетки в инвертированном микроскопе, используя длиннофокусный объектив.
VI. При достижении видимого монослоя (5—6 сут) удалите среду, добавьте трипсин (0,25%) и после дополнительного вращения соберите клетки. Выход клеток будет очень близок к таковому во флаконах при условии добавления достаточного количества среды. Преимуществом предложенного метода является возможность легкого изменения отношения объема среды к площади поверхности роста клеток. Поэтому после окончания фазы роста объем среды может быть снижен, что приведет к более высокой концентрации накапливающегося продукта.
3.4. Наращивание клеток; этап 2, модификация вращающихся бутылей
Система вращающихся бутылей относится все еще к муль-тикультуральным системам и поэтому требует большого количества обслуживающего персонала и материалов. Для увеличения поверхности для роста клеток внутри вращающихся бутылей разработаны следующие приспособления (рис. 3.6).
3.4.1. Пленки
Большой культуральный сосуд фирмы Sterlin, размерами 25X10 см снабжается патроном, содержащим свернутую по спирали пластиковую пленку с общей поверхностью 8500 см2. Строго говоря, эта система не относится к вращающимся бутылям, поскольку вращение со скоростью 2—3 об/ч осуществляется только на фазе прикрепления клеток (3—16 ч). После прикрепления клеток сосуд устанавливается вертикально, и, поскольку весь он заполнен средой (1,8 л), аэрация осуществляется путем пробулькивания. Эта система успешно используется для линий гетероплоидных клеток, таких как ВНК и ЗТЗ,
