Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Схема эксперимента
I. Приготовьте достаточно среды для перфузии.
II. Включите циркуляцию среды между резервуаром и культуральным сосудом до уравновешивания системы по температуре и pH (выждать достаточное время для прогрева стеклянных бус до 37 °С).
III. Добавьте порцию клеток (~1ХЮ4/см2) к объему среды, равному свободному объему колонки.
IV. Выпустите среду из колонки с бусами в резервуар, тщательно перемешайте клеточную суспензию и введите в ко-
лонку с бусами.
V. Перекройте все соединения и дайте возможность клеткам прикрепиться (3—8 ч в зависимости от типа клеток).
VI. После прикрепления клеток начните перфузию колонки средой, сначала с низкой скоростью (1 см в 10 мин). Ви-зуалыю контролируйте помутнение оттекающей среды, свидетельствующее об отсутствии прикрепления клеток (в этом случае прекратить перфузию).
VII. После 24 ч скорость перфузии может быть увеличена, но
не выше, чем до 5 см/мин; в противном случае может
происходить смыв клеток (особенно находящихся в митозе). Контролируйте pH на входном участке и сравнивайте концентрации глюкозы во входной и выходной заглушках для отбора образцов. Результаты этих измерений покажут достаточность скорости тока среды.
VIII. Контролируйте рост клеток по результатам определения концентрации глюкозы. Скорость утилизации глюкозы следует определять эмпирически для каждого типа клеток и используемой среды, но приблизительная оценка дает результат 2—5-108 образующихся клеток на 1 г глюкозы.
IX. Когда культура по вашим оценкам достигнет полного монослоя, отключите перфузионную систему, удалите из колонки среду, промойте колонку буфером и добавьте смесь трипсин-—версен (или проназы и т. п.) в количестве, равном свободному объему колонки; оставьте на 15—30 мин. Сбор клеток может быть ускорен сливом трипсина и обратным добавлением в колонку. Другим способом ускорения сбора клеток может служить пробулькивание газа через колонку (с очень низкой скоростью во избежание смещения бус и повреждения клеток).
X. Культуральный сосуд должен быть вымыт немедленно после использования. В противном случае его будет очень трудно очистить. Для этого необходимо обеспечить непрерывную циркуляцию через систему раствора детергента (типа Декон), затем водопроводной воды и нескольких смен дистиллированной воды. Стерилизуйте сосуд паром,
Таблица 3.3. Сравнение
Цитодекс 1 Цитодекс 2 Цитодекс 3 Супсрбу 1
Производитель Pharmacia Pharmacia Pharmacia Flow La's
Материал ДЭАЭ- ДЭАЭ- Коллаген ДЭАЭ-
сефадекс сефадекс (60 мг/см2) сефаде! с
Удельный вес 1,03 1,04 1,04 1,03
Форма Сферич. Сферич. Сферич. Сферич
Размер (диаметр 160---230 115---200 130---210 150---200
в мкм)
Площадь поверхности, 6000 5500 4600 6000
см2/г
Стоимость/м2 (в про 2,5 2,8 4,0 4,0
извольных едиинцах)
Поставка Сухой не Сухой не Сухой не Раствор
стерильный стерильный стерильный стерильный
если вам необходимо отобрать контрольные пробы (02, pH). Используйте бусы из пирекса вместо обычных лабораторных бус, изготавливаемых из Na-силикатного стекла.
3.6.2. Гетерогенный реаитор
Этот метод культивирования основан на том же принципе, что и дисковая вращающаяся культура, описанная ранее (разд. 3.4.2). Круглые пластины из стекла или нержавеющей стали устанавливаются вертикально на центральном стержне на расстоянии 5—7 мм друг от друга. Этот стержень может быть неподвижным, тогда для перемешивания используется воздушный лифт. Другой вариант состоит во вращении стержня вокруг вертикальной (6 об/ч) либо горизонтальной (50— 100 об/мин) оси. Известны сообщения об использовании муль-типоверхностных реакторов [15] объемом от 7,5 до 200 л, обеспечивающих рабочую поверхность до 2ХЮ5 см2. Опыт автора ограничен работой только с системами с горизонтально расположенными дисками (рис. 3.6, стопа пластин), которые просты в обращении и успешно используются для гетероплоидных и диплоидных клеток человека. Главным недостатком этого типа культур •является высокое отношение объема среды к рабочей поверхности (1 мл на 1—2 см2). Не удается добиться существенного улучшения этого параметра при переходе к системам с горизонтальными дисками, хотя в последнем случае отношение оказывается вдвое ниже, чем в системе с вертикально вращающимися дисками.
микроносителей
Бионосители Биосилон Цитосферы Гелибусы Целлюлоза Акробусы
Bio Rad Nunc Lux КС Bio Whatman Galil
Полиак Полисти Полисти logical ДЭАЭ-цел- Различ
риламид рол рол Желатин люлоза ный
