Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
поскольку в обычной бессывороточной среде он быстро теряет свою биологическую активность. Инсулин может также имитировать действие родственных пептидов вследствие наличия гомологичных аминокислотных последовательностей с ИРФ и соматомединами. Трансферрии должен добавляться в культуру насыщенным ионами Fe2+. Среди микроэлементов селениты играют особую роль благодаря их способности активировать глутатионредуктазу — ключевой фермент в метаболизме Ог, а следовательно, в энергетическом метаболизме клеток. Глюко-кортикоиды увеличивают эффективность клонирования глиальных клеток, фибробластов, хондроцитов, кератиноцитов и эпителиальных клеток бронхов, молочной и предстательной желез. Экзокринные клетки могут также требовать присутствия в среде специфических гормонов (например, эстрогена, пролактина и прогестерона для клеток молочной железы). Для некоторых клеток оказывается полезным добавление в среду трииодтиро-нина, а ФРЭ часто добавляется в культуры многих различных типов эпителиальных клеток.
В целом в настоящее время невозможно установить общие принципы составления универсальной бессывороточной среды. Во многих случаях метод проб и ошибок является единственным методом подбора ингредиентов для оптимальной среды. Как уже говорилось, оптимальной исходной средой для монослойной культуры является смесь DME и F12 в соотношении 1:1с добавлением инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селенита (30 нМ), ФРЭ (25 нг/мл), альбумина (1 мг/мл). Систематическое удаление одного из компонентов может помочь идентифицировать незаменимый фактор или факторы. Предложенный Хэмом [7] метод составления среды по лимитирующему фактору может в ряде случаев привести к выбору оптимальной концентрации незаменимого компонента. Однако этот «лобовой» подход требует много времени и перебора большого количества вариантов.
На начальных стадиях отбора удобно воспользоваться списком 44 бессывороточных культуральных сред с различными добавками, приведенным в табл. 2.2. Для начала следует выбрать среду, близкую по составу к той, на которой хорошо росли аналогичные клетки. Следует помнить, что среда, составленная для данного типа клеток, может, как правило, обеспечивать рост другой линии клеток или первичной культуры клеток другого происхождения при условии, что все эти клетки относятся к одному и тому же типу.
3.2.7. Значение микроэлементов
Роль микроэлементов трудно переоценить. Недавно Кливленд с сотрудниками [16] сообщили, что им удалось избежать добавления инсулина, трансферрина, БСА и липосом в бессыво-
роточную среду гибридом благодаря качественному расширению состава микроэлементов среды. В результате была получена среда, полностью свободная от белков и пептидов. Помимо обычных микроэлементов (в ионной форме) Fe, Си, Mn, Si, Mo, V, Ni, Sn, Zn и Se они включили в среду также Al, Ag, В a, Cd, Со, Cz, F, Ge, I, Rb и Zr. Возможность удаления из среды альбумина, трансферрина и инсулина авторы рассматривают как важный этап в развитии гибридомных исследований, поскольку эти белки являются возможным источником артефактов при использовании моноклональных антител для идентификации антигенов клеточной поверхности. При биотини-лировании моноклональных антител для иммунофлуоресцент-ного обнаружения поверхностных антигенов наблюдается биотинилирование также инсулина и трансферрина, взаимодействующих со специфическими рецепторами. Более того, коммерческие препараты альбумина и трансферрина также часто содержат примеси иммуноглобулинов.
4. Практические советы для выбора среды и работы с ней
4.1. Общие правила и предостережения
I. Должна быть уверенность в том, что в ходе приготовления среды и в процессе вашей работы с ней, не произойдет утраты или инактивации незаменимых питательных веществ и ростовых факторов.
а) Ионы Fe2+ могут окисляться до Fe3+, преципитировать и теряться при стерилизации фильтрованием {7]. Поэтому добавляйте Fe2+ непосредственно перед стерилизацией среды.
б) Смешивание концентрированных растворов с Са2+ и Р043~ может приводить к образованию осадка Саз(Р04)2-
в) Высокие концентрации цистеина могут инактивировать инсулин, так что концентрация цистеина должна быть снижена до 10 мкМ. При невозможности следует добавить другой восстанавливающий агент (например, ди-тиотреитол или тиоглицерин).
г) Микроэмульсии и липосомы всегда готовьте перед употреблением. Ненасыщенные жирные кислоты могут окисляться; микроэмульсии и липосомы могут частично теряться при стерилизации среды фильтрованием. Проверяйте цитотоксичность стабилизаторов липосом.
II. Клетки в безбелковой среде более чувствительны к стрессовым воздействиям культивирования, чем клетки в среде с сывороткой [17]. Поэтому чаще пересевайте клетки, растущие в бессывороточной среде.
III. Не используйте для посева клетки в низкой концентрации (менее 104 клеток/мл), поскольку в таких условиях они могут не выжить.
IV. Проверяйте условия культивирования: качество воды (бактериальные токсины, пирогены), состав газовой фазы (снижение концентрации О2 может усилить рост клеток).
