Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
уменьшающие l^max), бесконкурентные (в одинаковой степени уменьшающие Кт
и Vrnax) И СМвШаННЫв (произвольно меняющие Кт и Vmax)* Активаторы
разделяют на обычные и необходимые.
Как было указано выше, анализ наклонов и пересечений кинетических кривых
с осями позволяет в ряде случаев определить кинетические константы. В
табл. 1 приведены выражения этих величин для основных типов
ингибирования. Подобный анализ не дает должных результатов, когда
зависимость скорости от концентрации не является гиперболической, и
поэтому график обратных величин нелинеен. Отклонения от линейности
наблюдаются, например, при частичном конкурентном ингибировании или
неконкурентном ингибировании в стационарных условиях, в ряде случаев
смешанного ингибирования и др.
В таких системах в стационарных условиях получаются уравнения, содержащие
как S2, так и i2; возможно возникновение членов и с более высокими
степенями (S - концентрация субстрата, i - концентрация ингибитора).
Подобная ситуация возникает и тогда, когда с одной и той же молекулой
фермента может связываться более одной молекулы ингибитора.
Попытки анализа нелинейных эффектов ингибирования были предприняты еще в
50-х годах, когда Дж. Боттс и М. Моралес предложили схему действия
модификаторов (рис. 3). Для этой
28
Рис. 3. Схема неупорядоченного связывания с ферментом (Е) субстрата (S) и
модификатора (Af)
Таблица 1. Выражения для длин отрезков, отсекаемых на осях координат, при
построении графиков в двойных обратных величинах
Ингибирование Длина отрезка, отсекаемого на оси ординат Длина
отрезка, отсекаемого на оси абсцисс Наклон
Полное конкурентное 1 1 1 KmO+tlKl)
\ + (Ks/S)[l + (ilKi)] ^шах и Кт(\ +ilKi) ^max
Частичное конкурентное ke 1 1 + IKslKiK's Ks (I + HKi) KsO+l/Ki)
1 + (ATs/S) [1 + <.'/ + (ПК,) Л 1 Х (Ks/Ks)] V^max • ^шах(1
+KS/KlKs)
Полное неконкурентное ke/(\+t/Ki) 1 + t/Ki I KsO+l/Ki)
1 +(Ks/S) ^inax Ks ^max
Частичное неконкурентное [ke+k'e(i/Ki)]/0+i/Ki) 1 + ilKi 1
Ks(\+i/Ki)
V 1 + KsJS V шах + V'UKl Ks Vmax + V\Ki
Продолжение табл. 1
Ингибирование Длина отрезка, отсекаемого на оси ординат Длина
отрезка, отсекаемого на оси абсцисс Наклон
Смешанное ^шах 1+1/К] i+w; Ksd + t/Ki)
(KS/s)o+w/)+o+//*;> ^тах Ks(\+i/Ki) V max
Частичное смешанное *"(i+*;//";)/(! +чк,) 1 + ЦК] J +HK] в KsO
+l/Ki)
V~ i + [KsO + l/Ki)]IS(l+UK',) ke(l + k'2 ЦкК]) KsO+HKt) ke(l +
k]/kK])
Бесконкурентное ^max 1 + I/Kt 1 +//АГ/ Km
" (Km/S) + (l+i/Kt) ^тах Km ^max
Частичное бесконкурентное и *+2<? 1 1 +i/Ki 1 +i/Kt Ks
" \ + (Ks/S) + {i/Ki) ' 1 + {Kill) (1 +Ks/S) k+2? [1 +(^+з/^+2)0/Kf)]
Ks ?+2* [1 + (*+з/*+2) (*/^/)
схемы уравнение скорости в стационарных условиях принимает вид:
[(a + т S* + (е + dM + еМЦ S]
(f + gM)Si + (h +iM + JM*)S (k + 1JW + тМ2) * * '
где а, Ь,...,т - положительные константы, 5 и М - концентрации субстрата
и модификатора.
При постоянной концентрации фермента и модификатора или фермента и
субстрата уравнение в общем виде является дробнорациональной функцией
второго порядка:
*=3±o!?±*?t (2.11)
Ро + М + Р**2
где х - концентрация лиганда.
Графики зависимости v от х, отвечающие уравнению (2.11), могут иметь
различный вид в зависимости от значений отдельных констант. В работе Дж.
Боттс (J. Botls, 1958) показано, что кривые могут иметь только один
максимум и не более двух точек перегиба. Всего для такого случая возможно
существование десяти типов кривых. Соответствующие графики в двойных
обратных координатах рассмотрены У. Фердинандом (W. Ferdinand, 1966),
проанализировавшим условия, при которых уравнению (2.11) соответствует та
или иная кривая. Подход, предложенный Боттс и основанный на анализе
геометрических характеристик кривых, был затем развит в работах ряда
авторов (W. Bard&Iey, R. Childs, 1975; W. Bardsley, 1976; W. Bardsley et
al., 1980; F. Solano-Munoz et al., 1981; F. Burgillo et al., 1983).
Результаты этих исследований более подробно будут рассмотрены в гл. 3.
Исследование формы кинетических кривых в различных координатных системах
3
3.1. Основные геометрические характеристики формы кинетических кривых
При анализе дробно-рациональных функций, описывающих стационарную
скорость и связывание лигандов, перед исследователями возникает ряд
специфических трудностей. Из-за того что коэффициенты уравнений
представляют собой сложные комбинации кинетических констант, полезная
информация, получаемая при анализе наклонов и пересечений кинетических
кривых с осями, весьма ограничена. Уравнения содержат концентрационные
члены в высоких степенях, и определение степенных параметров по
экспериментальным кривым является самостоятельной важной задачей.
Детальному анализу дробно-рациональных функций вида:
посвящена серия работ У. Бэрдсли и соавторов, которые, применив теорию
плоских кривых, провели математический анализ возможных форм кинетических
кривых. На основе изучения геометрических признаков, характеризующих
форму кривых в различных системах координат, был предложен способ
