Биохимия мембран. Кинетика мембранных транспортных ферментов. Том 5 - Кометиани З.П.
ISBN 5-06001355-3
Скачать (прямая ссылка):
v=-v-mdx -. (2.5)
1 + km/S
Это уравнение идентично уравнению Михаэлиса с той разницей, что Km
заменено на Ks- При k+2<^k-i константа Km приближается к Ks и, таким
образом, является мерой сродства фермента к субстрату. В стационарных
условиях, однако, не следует судить о сродстве по величине Km. Несмотря
на это, величины Km и Утах представляют собой важные кинетические
параметры, так как они полностью определяют зависимость скорости от
концентрации субстрата для данного фермента.
Для определения величин Km и Vmax предложено несколько методов,
основанных на преобразовании уравнения (2.5). К наиболее распространенным
графическим методам относятся следующие.
1. Метод Лайнуивера - Берка, согласно которому анализируется зависимость
\/v от 1/5. Уравнение (2.5) в обратных координатах представляет собой
уравнение прямой с наклоном К iv max И пересечениями: на оси ординат в
точке 1/Утах и на оси абсцисс в точке (-1/Km) (рис. 2, а).
2. Уравнение (2.5) описывает прямолинейную зависимость в координатах S/v
от 5 (график Диксона). В этом случае наклон прямой равен 1/Ушах и она
пересекает ось ординат в точке Кт/Утвх, а ось абсцисс в точке (-Кт) (рис.
2, б).
3. Построение графика в координатах Ушах от Кт также позволяет определить
величины Утах и Кт, так как наклон прямой в этом случае равен (-Кт),
пересечение с осью ординат равно Ушах, а с осью абсцисс- Утвх/Кт (рис. 2,
в).
4. Метод, предложенный Р. Эйзенталем и Э. Корниш-Боуден не
предусматривает построения графика по экспериментальным точкам. Значения
у и 5 откладывают на вертикальной и горизонталь-
23
ной осях соответственно и через каждую пару точек проводят прямую. Все
прямые должны пересекаться в точке с координатами (Кт, V'max). Если не
все прямые пересекаются строго в одной точке, то авторы предлагают
получить оптимальное значение Кт по среднему значению (рис. 2, г).
Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Vmix по зависимости
скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)
Для определения параметров Кт и Vmax можно использовать график хода
реакции. Для этого уравнения Михаэлиса записывают в интегральной форме:
Ут.^ = У+Кт In -S°- . (2.6)
S0 - y
где So - начальная концентрация субстрата, а (50-у) - концентрация в
момент времени /. Преобразуя (2.6), получим:
2,303
24
lg
Sr\ -
max
л
t
(2.7)
Измерение у через определенные промежутки времени и построение графика
зависимости (2,303//) lg(So/(So-*/)) от y/t позволяет получить прямую с
наклоном (-1 /Кт) и пересечением с осью абсцисс Ктах/Кт-
В последние годы предложен метод для определения констант Кт и Vmax,
основанный на анализе кривых хода реакции и определения той концентрации
субстрата, при которой вторая производная скорости по времени достигает
минимума. Эта концентрация равна S=Km/2. Для получения этой величины
необходимо наблюдать за ходом реакции не до конца, а лишь до того
момента, когда вторая производная пройдет минимум (В. Hasinoff, 1985).
Предложен также метод определения Кт и Ктах на основе измерений начальных
скоростей для случаев, когда субстрат нестабилен и может распадаться не
только в ходе ферментативной реакции, но и другим путем (Т. Keleti,
1986).
2.2. Кинетический анализ реакций с участием нескольких субстратов и
продуктов
Большинство ферментов не подчиняются таким простым схемам реакций, как
(2.1) или (2.3), тем более если в реакции участвует несколько субстратов
и продуктов. В общем случае для получения уравнения скорости для сложных
механизмов используют метод Кинга - Альтмана и его модификации (см. гл.
1), но анализ дробно-рациональной функции при этом связан с трудностями,
и определение кинетических констант Кт и Ушах при нелинейных графиках 1
fv от 1/S необосновано. Необходимость изучения многосубстратных реакций,
однако, остается, и поэтому ряд авторов проанализировали многочисленные
частные случаи, которые в силу различных допущений можно описать,
используя методы линейной кинетики. В данном разделе приведен подход У.
Клеланда, представляющий собой попытку привести уравнения скорости к
форме, которая содержит параметры с определенным физическим смыслом и
поддающиеся экспериментальному определению.
Для механизмов с более чем одним субстратом и продуктом необходимо
вначале написать полное уравнение скорости в терминах индивидуальных
констант скорости и затем преобразовать его, введя для каждого реактанта
константы Михаэлиса и константы ингибирования. Рассмотрим метод на
примере упорядоченной "уни-би" реакции, т. е. реакции с упорядоченным
присоединением одного субстрата и выделением двух продуктов:
А Р Q
1 1 \
h к 2 к3 Ч *5 кВ
Е EA/EPQ EQ Е
25
(c)=-
Уравнение скорости получим методом Кинга - Альтмана:
________________________ (kik3k5A - k2k^kGPQ) Et_____________________
V + Л3) Л5 4- k\ (Л3 + k3) A + k?fnP -4- (ki + k3) k^Q + k\k^AP +
kffisPQ
(2.8)
Для последующего анализа удобно записать уравнение (2.8) в следующем
