Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
216
Глава 9
Таблица 4. Частота трансформации различных бактерий ДНК RSF1010
Бактерия-хозяин1) Фенотип2) Частота трансформации
(на 1 мкг ДНК RSF1010)
Е. coli SK1592 AsdR /isrfM+ 3,6- 10s
P. aeruginosa РА01162 rmo mod* 6,7-104
P. putida met-2 КТ2440 rmo mod+ 3-103
P. putida mt-2 r/no+ mod+ 3-101
(повышается до 8-10s при
использовании ДНК, моди
фицированной в хозяине)
') См. работу [9].
2) hsdR --- определяемая хозяином рестрикция; hsd№+ --- определяемая хозяином мо
дификация; гто --- определяемая хозяином рестрикция; mod+ --- определяемая хозяином
модификация.
гих грамотридательных бактерий такие мутанты почти неизвестны, что делает крайне трудной или даже невозможной трансформацию этих бактерий чужеродной ДНК. Тем не менее у P. putida и P. aeruginosa, обладающих высокоэффективной системой рестрикции [9, 21], удалось получить штаммы (гто) с пониженной способностью к рестрикции [9]. Таблица 4 показывает, с какой эффективностью эти мутанты Pseudomonas трансформируются плазмидной ДНК Для сравнения приведена эффективность трансформации штамма hsd Е. coli SK1592 и P. putida mt-2 гто+. Эффективность трансформации P. aeruginosa Ра01162 гто и P. putida 2440 гто значительно ниже, чем Е. coli. В случае P. putida mt-2 rmo+ эффективность трансформации гетерологичной ДНК еще ниже, однако при использовании модифицированной в хозяине плазмидной ДНК ее уровень повышается до уровня трансформации дефектных по рестрикции штаммов.
Трудности, связанные с низкой эффективностью трансформации, в большинстве случаев делают нереальными попытки прямой трансформации этих бактерий продуктами реакции лигирования. Наилучший подход состоит в использовании в качестве промежуточного хозяина для трансформации и скрининга рекомбинантных плазмид Е. coli. После идентификации и очистки нужной рекомбинантной плазмиды ее используют для трансформации желаемого хозяина. Метод с использованием амплификации в Е. coli позволяет значительно повысить вероятность успешной трансформации выбранного хозяина. Представленный ниже метод трансформации основан на методике Кашнера [22], модифицированной для обеспечения приемлемой эффективности трансформации бактерий типа Pseudomonas с использованием: очищенной ДНК [9].
Векторы для грамотрицательных бактерий
217
1. Инкубируйте бактерии в L-бульоне [23] до ОПб5о = 0,3—0,4.
2. Соберите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 7000 об/мин и 0 °С. Удалите надосадок.
3. Осторожно суспендируйте клетки в том же объеме охлажденного во льду буфера для трансформации (10 мМ MOPS pH 7,0; 10 мМ RbCl, 100 мМ MgCb) и отцентрифугируйте так же, как на стадии 2.
4. Осторожно ресуспендируйте клетки в таком же объеме охлажденного во льду буфера для трансформации и проинкубируйте 30 мин при 0°С.
5. Соберите клетки центрифугированием, удалите надосадок и ресуспендируйте в 1/10 объема охлажденного во льду буфера для трансформации.
6. Разделите суспензию клеток на аликвоты по 0,2 мл и добавьте ДНК (до 1 мкг в максимальном объеме 25 мкл). Проинкубируйте 45 мин при 0°.
7. Подвергните клетки тепловому шоку 2 мин при 42 °С.
8. Добавьте к суспензии 2 мл L-бульона и проинкубируйте 90 мин при 30 °С.
9. Рассейте аликвоты объемом 0,1 мл на селективной среде.
Обратите внимание, что буфер для трансформации не содержит СаС12. Эта соль обычно применяется для трансформации Е. coli. Мы также использовали ее для трансформации бактерий Pseudomonas sp. Однако СаСЬ, по-видимому, обусловливает гибель клеток Pseudomonas, понижая эффективность трансформации в —10 раз (Багдасарьян и Франклин, неопубликованные данные).
3.4. Введение векторов с широким спектром хозяев в бактерии-реципиенты путем мобилизации
Трансформация многих видов грамотрицательных бактерий в настоящее время невозможна. Вероятно, в будущем, когда эти бактерии будут изучены более тщательно, такие способы появятся, однако сейчас методы рекомбинантных ДНК находят ограниченное применение для генетического анализа этих бактерий. К счастью, кроме трансформации существует и другой метод введения рекомбинантных плазмид в бактерии-реципиенты— мобилизация плазмид. Этот метод обладает преимуществами и для тех видов, которые способны трансформироваться, поскольку не предусматривает обязательной при трансформации Pseudomonas и родственных бактерий очистки ДНК. При введении большого числа рекомбинантов в бактерии-реципиенты очистка ДНК может стать проблемой, так как выделение плазмидной ДНК из нескольких сотен клонов занимает длительное время. Хотя можно выделить плазмидную ДНК сразу из нескольких клонов и трансформировать бактерии этим суммар-
