Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Следует отметить, что все векторы, полученные на основе RSF1010, заметно крупнее обычно используемых векторов Е. coli. На начальном этапе разработки основанных на RSF1010 векторов было сделано немало попыток уменьшить размеры плаз-мидных репликонов [9, 10]. Все они закончились неудачей. Недавние исследования [10] показали, что причина этой неудачи заключена в сложности репликационного механизма плазмиды. Для репликации необходимы по крайней мере три гена, герА, герВ и герС, расположенные в геноме плазмиды в нескольких т.п.н. от точки начала репликации (Ori, см. рис. 1). Таким образом, лишь небольшая часть генома плазмиды может быть удалена без нарушения репликации. В связи с этим получение векторов, сравнимых по размеру с плазмидами Е. coli,— задача необычайно трудная.
Плазмидные векторы на основе RSF1010 сейчас используются при работе со многими грамотрицательными бактериями (табл. 3).
2.2. Векторы на основе Inc W-плазмиды
В лабораториях Кадо [14] и Шелл [15] были сконструированы многоцелевые векторы на основе плазмиды pSa. Плазмида pSa имеет молекулярную массу 29,6 т.п.н. и принадлежит к группе несовместимости W. Полученные на ее основе векторы представлены в табл. 2. Начальный этап конструирования векторов заключался в делеции из плазмиды генов конъюгативного переноса и получении «мини-Sa». В дальнейшем в нее были введены селективные маркеры и ряд пригодных для клонирования сайтов рестрикции. В отличие от RSF1010 выделение
214
Глава 9
Таблица 3. Спектр хозяев для векторов на основе RSFI0101)
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Agrobacterium tumefaciens Azotobacter vinelandii Alcaligenes eutrophus Alcaligenes faecalis Acetobacter xylinum Methylophilus methylotrophus Rhodopseudomonas spheroides Rhizobium meliloti Rhizobium leguminosarum Caulobacter crescentus Yersinia enterocolitica Klebsiella aerogenes Serratia marcescens Erwitiia coratovora Xanthomonas compestris Gluconobacter sp.
>) По данным работ [9] и [13].
плазмиды «мини-Sa» оказалось несложным. Кодирующая устойчивость к Кт. и Sp плазмида pGV1106 [15], например, была получена путем рециркуляризации В^Ш-фрагмента pSa длиной 8,4 т. п. н.
Векторы на основе pSa представляют собой полезное дополнение к векторам типа RSF1010. Более того, поскольку эти векторы принадлежат к различным группам несовместимости, они могут стабильно сосуществовать в одной бактериальной клетке. Это открывает возможности проведения генетического анализа, в частности исследования комплементациии между клонированными последовательностями в большом наборе грамотрицательных бактерий.
3. Практическое применение векторов с широким спектром хозяев
В этом разделе приведены основные методы работы с векторами.
3.1. Выделение векторной ДНК
Большинство обычно используемых методов выделения дают удовлетворительные результаты, особенно если плазмиду размножают в Е. coli. Если ДНК предназначена для клонирования, полезно очистить ее в градиенте плотности CsCl с этидиумбро-мидом. Воспроизводимо хороший выход дает метод «осветлен-
Векторы для грамотрицательных бактерий
215
ного лизата», описанный в работе [16]. Тем не менее необходимо отметить два момента. Во-первых, за редким исключением, при добавлении к культуральной среде хлорамфеникола не наблюдается избыточной репликации плазмиды в сравнении с хромосомной ДНК. Во-вторых, клетки Pseudomonas лизиру-ются быстрее, чем Е. coli. Поэтому время инкубации после добавления детергентов (Brij 58 или Тритон XI00) необходимо уменьшить до 1—2 мин. Если этого не сделать, то при центрифугировании «осветленного лизата» осадки будут неплотными и произойдет значительная потеря плазмидной ДНК. Кроме того, возникают трудности при отделении лизата от осадка разрушенных клеток.
Для проверки плазмидной ДНК, присутствующей в трансформантах, очень удобны аналитические методы выделения, особенно методы Холмса и Куигли [17] и Бирнбойма и Доли
[18]. Здесь так же, как при работе с некоторыми грамотрица-тельными бактериями, могут возникать трудности при лизисе клеток. Тем не менее метод Бирнбойма и Доли дает хорошие результаты для большинства проверенных на сегодняшний день бактерий.
3.2. Клонирование фрагментов ДНК с использованием векторов с широким спектром хозяев
Методические приемы клонирования ДНК в плазмидных векторах описаны очень подробно (см., например, работу [19]) и вполне применимы при клонировании в плазмидах с широким спектром хозяев. Необходимо лишь иметь в виду, что эти векторы обычно больше по размеру, чем стандартные векторы для клонирования в Е. coli. Вот почему для получения необходимых молярных концентраций «липких» или «тупых» концов при лигировании требуются большие концентрации линеаризованной векторной ДНК.
3.3. Трансформация грамотрицательных бактерий, не относящихся к энтеробактериям,
ДНК векторов с широким спектром хозяев
Несмотря на то что для Е. coli разработаны эффективные методы трансформации плазмидной ДНК (см., например, работу [9]), имеется лишь небольшое число примеров трансформации других грамотрицательных бактерий. Некоторые из них, например P. stutzeri и Thiobacillus sp., могут трансформироваться линейной двухцепочечной ДНК без предварительной химической обработки клеток [20]. Для эффективной трансформации Е. coli плазмидами в качестве реципиента обычно используют дефектные по рестрикции (hsdR) штаммы. Для дру-
