Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Обнаружив содержащий мутацию клон, необходимо провести полный анализ последовательности, находившейся в чдДНК в одноцепочечной форме или, еще лучше, последовательности всего исследуемого гена, так как при работе ДНК-полимеразы 1 in vitro возможны ошибки. Иногда обнаруживаются клоны, содержащие дополнительные мутации (Б. Крамер, неопубликованные данные).
Благодарности
Многие описанные здесь методики обязаны появлением моим коллегам — У. Крамеру, В. Друтсу. Б. Крамеру и М. Пфлюгфельдеру. Работа финансировалась Deutsche For-schungsgemeinschaft через Sonderforschimgsbereich 74.
Литература
1. Hutchinson С. A., Ill, Edgell М. Н. J. Virol., 8, 181 (1971).
2. Zoller М. J., Smith M. Methods in Enzymology, 100, 468 (1983).
3. Wilkinson A J., Fersht A. R., Blow D. М., Carter P., Winter G. Nature, 307, 187 (1984).
4. Messing J. Methods in Enzymology, 101, 20 (1983).
5. Kramer W., Sch.ugh.art K-, Fritz H.-J. Nucleic Acids Res., 10, 6475 (1982).
6. Loeb L. A., Kunkel Th. A. Annu. Rev. Biochem., 52, 429 (1982).
7. Wagner R. E., Jr., Meselson M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4135
(1976).
8. Rodman М., Wagner R. E., Jr., Glickman B. W„ Meselson M. In: Developments in Toxicology and Environmental Sciences, Vol. 7, Progress in Envi-
ronmental Mutagenesis, Alacvic H. (ed.), Elsevier North Holland, Amsterdam, pp. 121 (1980).
9. Pukkila P. J., Peterson J., Harman G., Modrich P., Meselson M. Genetics, 104,571 (1983).
10. Herman G. E., Modrich P. J. Biol. Chem., 257, 2605 (1982).
11. Beck E., Zink B. Gene, 16, 35 (1981).
12. van Wezenbeek P. M. G. F., Hulsebos T. J. М., Schoenmakers J. G. G. Gene,
11, 129 (1980).
13. Kramer B., Kramer W., Fritz H.-J. Cell (1984), in press.
14. Lu A.-L., Clark S., Modrich P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4639 (1983).
15. Kramer W., Drutsa V., Janven H.-W., Kramer B., Pflugfelder M„ Fritz H.-J. Nucleic Acids Res., 12, 944 (1984).
16. Sanger F„ Nicklen S., Coulson A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463
(1977).
17. Walker J. ?., Gay N. J. Methods in Enzymology, 97, 195 (1983).
18. Kornberg A. DNA Replication, W. H. Freeman, San Francisco, pp. 476, (1980).
19. Gait M. J. (ed.). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, published by IRL Press, Ltd., Oxford, 1984.
20. Maniatis Т., Fritsch E. F„ Sambrook J. Molecular Cloning, published by Cold Spring Harbor, New York, 1981. [Имеется русский перевод: Маниа-тис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984.]
21. Biggin М. D., Gibson Т. J., Hong G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3963 (1983).
ГЛАВА 9
ВЕКТОРЫ ДЛЯ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИИ, ИМЕЮЩИЕ ШИРОКИИ СПЕКТР ХОЗЯЕВ
Ф. Кристофер X. Франклин
1. Введение
Метаболизм грамотрицательных бактерий характеризуется рядом особенностей, важных для сельского хозяйства, медицины, а также с точки зрения охраны окружающей среды. Например, бактерии Rhizobium способны фиксировать азот [1], Thiobacillus — окислять серу и железо [2], a Pseudomonas — метаболизировать экзотические органические соединения, такие, как нафталины, фенолы и галогениды [3]. В большинстве случаев генетический контроль этих процессов изучен слабо, в основном потому, что сами эти организмы часто недостаточно исследованы. Методы клонирования генов предоставляют мощный инструмент, позволяющий анализировать интересующие нас свойства бактерий и в конечном итоге использовать их в хозяйственных целях. Лучше всего разработана система клонирования на Escherichia coli, ее плазмидах и фагах. Эта система прекрасно подходит для грамотрицательных энтеробактерий, родственных Е. coli, однако для других видов, таких, как Pseudomonas, ее применение ограничено. Имеющиеся данные указывают, что экспрессия в Е. coli генов неродственных грамотрицательных бактерий происходит малоэффективно. Если, например, набор генов, участвующих в катаболизме толуола/ксилола, из P. putida mt-2 ввести целиком в Е. coli, уровень их экспрессии составит лишь 1—5% от нормального уровня у Pseudomonas [4]. Следовательно, изучение экспрессии клонированных генов этих бактерий в Е. coli затруднено. Кроме того, фаговые и плазмидные векторы, разработанные для Е. coli, основаны на репликонах с узким спектром хозяев. Если источник гена не является энтеробактерией, реинтродукция клонированной ДНК для изучения экспрессии в естественного хозяина часто невозможна. Такие эксперименты, однако, нередко необходимы, особенно если изучаемая активность в норме проявляется в особых условиях, к которым естественный хозяин гена приспособлен. Thiobacillus ferrooxidans, например, окисляет железо только в чрезвычайно кислой среде. Анализ генов грамотрицательных бактерий затруднен не только в Е. coli. Сходная проблема возникает и при работе с генами дрожжей или бацилл. Решить эту проблему в большинстве случаев удавалось путем конструирования векторов, спо-
