Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
*) Десятикратный буфер для EcoRI содержит 1 М триоНС! pH 7,2; 500 мМ NaCl, 50 мМ MgCl2; 20 мМ 2-меркаптоэтанола.
2) Десятикратный буфер для лигирования содержит 600 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ MgCl2; 100 мМ 2-меркаптоэтанола; 10 мМ ЭДТА и 1 мМ АТР.
Полезным может оказаться применение redr-векторов NM641 [8], NM1150 [4] и даже хозяина гесА~, такого, как NM553 (hfl~ г~ m+; Н. Мюррей, личное сообщение). Кроме того, описаны перестройки последовательностей, явно относящиеся к артефактам, связанным с обратной транскрипцией [15].
Как подробно обсуждалось в гл. 2, вектор XgtlO сконструирован специально для клонирования эукариотических мРНК средних размеров. При клонировании вставок большого размера (>5 т.п.н.) следует использовать другие векторы, способные включать большие фрагменты, например NM1149 или его red~-.производное, NM1150.
Нередко первый клон, выделенный из библиотеки при скрининге, представляет собой лишь часть мРНК (что видно при сравнении его длины с длиной соответствующей мРНК, определенной путем переноса на нитроцеллюлозу). Более длинные клоны обычно получают при повторном скрининге библиотеки зондом, полученным на основе короткого клона. К сожалению, при этом может произойти отбор клонов, содержащих посторонние (не относящиеся к мРНК) последовательности, захваченные в ходе присоединения линкеров (число таких последо-
Методика синтеза двухцепочечной кДНК для клонирования
117
вательностей можно уменьшить, используя при лигировании большие избытки линкеров) или при лигировании вектора с кДНК (при этом неизбежно, хотя и в небольшом количестве, появляются двойные вставки). Если клон кДНК при Нозерн-блотинге гибридизуется со многими мРНК (особенно если этот клон содержит ^coRI-сайты), то к нему следует отнестись с осторожностью. Во всех случаях, когда это возможно, следует выяснить, совпадают ли рестриктные карты для независимо выделенных клонов. Необходимо определить 5'-концевую последовательность мРНК либо проверить ее, используя в качестве затравки при достройке цепи (при достаточном количестве РНК) или сравнивая ее с последовательностью геномного клона.
Благодарности
Мы благодарим Хирото Окаяму и Пола Берга (Станфорд), сообщивших нам до публикации условия синтеза второй цепи. В разработке методики участвовали сотрудники лаборатории Ричарда Акселя (Майкл Палазоло, Скотт Цейтлин, Тони Клаудио, Грег Лемке). Мы благодарны Барбаре Уолд (Калтех), Рику Янгу (Станфорд) и Норину Мюррею (Эдинбург) за помощь и предоставленные нам штаммы.
Литература
1. Okayama Н., Berg P. Mol. Cell Biol., 2, 161 (1982).
2. Efstratiadis A., Kafatos F. C., Maxam A. М., ManiaUs T. Cell, 7, 279 (1976).
3. Gubler U., Hoffman B. J. Gene, 25, 263 (1983).
4. Murray N. E. In: Lambda II, Cold Spring; Harbor Laboratory Press, New York, 1983.
5. Williams B. G., Blattner F. R. In: Genetic Engineering: Principles and
Methods, Setlow J. K. and Hollaender A. (eds.), New York, Plenum, 1980.
6. Scherer G., Telford J., Baldari C., Pirrotta V. Dev. Biol., 86, 438 (1981).
7. Lathe R., Lecocq J.-P. Virology, 83, 204 (1977).
8. Murray N. E., Brammar W. J., Murray K. Mol. Gen. Genet., 150, 53 (1977).
9. Stanley K. R., Luzio J. В. EMBO J., 3, 1429 (1984).
10. Ruther U., Muller-Hill B. EMBO J., 2, 1791 (1983).
11. Chirgwin J. М., Przybyla A. E., Macdonald R. J., Rutter W. J. Biochemistry, 18 5294 (1979).
12 Cathala G., Savouret I.-F., Mendez B„ West B. L„ Karin M„ Martial J. A.,
Baxter J. D. DNA, 2, 329 (1983).
13 Maniatis T„ Friisch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982. [Имеется русский перевод: Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.— М.: Мир,
1984.]
14 Hall R Hyde J. Е., Goman М., Simmons D. L., Hope I. A., Mackay M„
' Scaife J., Merkli B., Richie R., Stocker J. Nature, 311, 379 (1984) _
15. O’Hare K-, Breathnach R., Benoist C., Chambon P. Nucleic Acids Res., 7, 321 (1979).
16 Scheller R H Jackson J. F., McAllister L. B., Rothman B. S., Mayeri E., ' Axel R. Ceil, 32, 7—22 (1982).
ГЛАВА А
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ! МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ХИМЕРНЫХ Р-ГАЛАКТОЗИДАЗ, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ ПЛАЗМИДНЫМИ ВЕКТОРАМИ
Михель Кёнен, Ганс-Вернер Гриссер и Бенно Мюллер-Хилл
1. Введение
В последние годы были сконструированы различные экспрессирующие векторы, использующиеся для клонирования геномной ДНК прокариот или кДНК эукариот. Появление таких векторов дало возможность идентифицировать клонированные ДНК, выявляя детерминируемые ими белки. Некоторые из экспрессирующих векторов содержат только необходимый для транскрипции промотор и необходимые для трансляции последовательность Шайна — Далгарно и инициирующий кодон. В состав других векторов входит ген-носитель, в который и вводится чужеродная ДНК.
