Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.5. Промывка
Снимите пластины с чашек и поместите в сосуд с промывочным раствором. Большая часть бактериальной массы колоний прилипает к пластинам. Этой массе дают набухнуть, инкубируя пластины, полностью покрытые промывочным раствором, в течение 20 мин при комнатной температуре. Весь неспецифическш налипший материал можно теперь удалить, промывая пластины струей промывочного раствора из шприца объемом 20 мл. Для. этого пластины помещают грязной стороной вверх в стеклянный сосуд с большой поверхностью. Чтобы грязь смывалась с: фильтра, сосуд держат под углом (рис. 6). Следите за тем,, чтобы пластины не соскальзывали в грязный промывочный раствор. В конце промывки не должно быть видно никаких следов колоний. Если грязь не смылась полностью, выдержите пластины еще 5—10 мин в свежем промывочном растворе. Чистые пластины промойте еще раз в течение 1 мин свежим раствором и поместите в пустые чашки Петри так, чтобы несущая иммунные комплексы сторона смотрела вверх.
4.6. Идентификация колоний, продуцирующих антигены
1. Расплавьте агар (3 г на литр воды) и держите его при-40 °С.
2. Смешайте равный объем жидкого агара с двукратным буфером TMSII, нагретым до 40 °С, внесите X-Gal до концентрации 0,16 мг/мл.
3. Охладите до 37 °С и залейте каждую пластину примерно* 15 мл агара.
128
Глава 4
'Рис. 6. Промывка: замочите пластины с прилипшими к ним колониями в промывочном растворе (1). Смойте бактериальную массу при помощи шприца (2). Промойте пластины в свежем растворе (3). Поместите чистые пластины в пустые чашки Петри (4). См. также раздел 4.5.
4. Когда агар застынет, проинкубируйте пластины при 37 °С в темноте. (X-Gal чувствителен к свету. На свету агар желтеет!)
X-Gal гидролизуется р-галактозидазой, входящей в состав химерного белка, связавшегося с антителом. Скорость появления окраски зависит от количества экспрессированной ^-галак-тозидазы, качества антигена, количества и чистоты антител. Для появления окраски может понадобиться от 2 до 20 ч. По нашему опыту, при использовании антител к индивидуальному белку (/ас-репрессор, лизоцим курицы) видимая окраска появляется примерно через 5 ч [5, 6]. При использовании антител, по-
Иммунологический метод выявления химерных ft-галактозидаз
129
лученных против смеси белков, окраска становится заметной через 12—20 ч. Колония, продуцирующая узнаваемый антителами антиген, проявляется в виде гомогенного синего облачка, сравнимого по размеру с лизированной колонией. Гомогенная окраска характерна только для дающих положительный сигнал клонов. При недостаточной промывке могут появляться ложные сигналы и фон. В таких случаях на границах колоний видны небольшие синие пятнышки, а гомогенного облачка синего цвета, характерного для положительного сигнала, не наблюдается. Все дающие положительный сигнал колонии необходимо проверять, заново рассевая их из колонии, хранившейся на эталонной чашке, и заново трансформируя бактерии содержащимися в них плазмидами.
4.7. Очистка химерных [5-галактозидаз
Одно из преимуществ описываемой системы состоит в том, что любой антиген можно выделить из экстракта клеток Е. coli в гомогенном виде в один этап. Очищенный антиген в виде химерного (состыкованного с ^-галактозидазой) белка можно прямо использовать для иммунизации. Для очистки химерных fi-ra-лактозидаз мы применяем метод Стирса с соавт. [21], в котором используется аффинная хроматография на р-амино-^-О-тиога-лактозидагарозе. Вариант этого метода описан Ульманом [22].
1. Инкубируйте клетки в 200 мл жидкой богатой среды в течение ночи. Для повышения стабильности химерных белков выращивайте клетки при комнатной температуре.
2. 1 г клеток ресуспендируйте в 1 мл 10 мМ трис-НС1 pH 7,5;
10 мМ ацетата магния; 200 мМ NaCl; 0,1 мМ ЭДТА; 1 мМ ДТЕ (буфер А).
3. Обработайте клетки 3 раза по 1 мин ультразвуком на ледяной бане с NaCl (Branson Sonifier, мощность 100 Вт).
4. Для осаждения обломков клеток центрифугируйте 1 ч при 40 000 g. Осадок проверьте на наличие ^-галактозидазной активности методом Миллера [18]. Если основная активность обнаруживается в надосадке, осадок можно отбросить.
5. Разбавьте надосадок, содержащий 35—45 мг/мл белка, равным объемом буфера А и нанесите его на 1 мл колонку с р-аминофенил-|3-0-тйогалактозидагарозой (Sigma), уравновешенную буфером А.
6. Для удаления неспецифически связанных белков промойте колонку 50—100 мл буфера А. Промывку ведите до тех пор, пока с колонки не перестанет в заметных количествах смываться белок.
7. Элюируйте связанную химерную ji-галактозидазу тремя объемами колонки 100 мМ Ыа-бората pH 10,05.
9—196
130
Глава 4
8. Немедленно отдиализуйте против 500 мл 40 мМ трис-НС! pH 7,5; 1 мМ MgCl2; 0,1 мМ ЭДТА; 1 мМ ДТЕ; 50% глицерина в течение 5 ч и храните при —20 °С.
Полученные таким образом химерные белки более чем на 90% гомогенны по данным электрофореза в ПААГ в присутствии SDS [23]. Чтобы не допустить деградации химерных белков, образцы для электрофореза готовят, прогревая их (вместо кипячения) 30 мин при 55 °С. Концентрацию белка можно определить методом Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [24]. Активность ^-галактозидазы определяют методом Миллера [18]. Все операции по очистке проводят при 4 °С.
