Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
®) Авторами с успехом используется обратная транскрнптаза вируса миелобластоза птиц, предоставленная Дж. Бердом. Одна единица обратной транскриптазы включает 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при 37 °С.
7) Удельная активность a[32PldGTP (Amersham) составляет 410 Ки/ммоль.
8) ТЕ содержит 10 мМ трнс-НС1 pH 8,0; 1 мМ. ЗДТА.
2.2. Синтез второй цепи кДНК
Размер получаемой по приведенному здесь методу двухцепочечной кДНК должен совпадать с размером матрицы (первой цепи кДНК) при электрофоретическом фракционировании в щелочном агарозном геле. В этом состоит основное отличие описываемого метода от приведенного в предыдущей главе, где длина денатурированной двухцепочечной кДНК примерно вдвое больше длины матрицы из-за соединяющей две цепи шпилеч-
Методика синтеза двухцепочечной кДНК для клонирования
111
ной структуры. При описанных ниже условиях вторая цепь должна получаться примерно в 10 раз «горячее», чем первая, так как при ее синтезе используется примерно в 10 раз меньшая концентрация немеченых нуклеотидов при той же концентрации метки. Таким образом, количество полученного на этой стадии радиоактивного продукта (двухцепочечной кДНК) будет отражать количество синтезированной второй цепи (рис. 1). Выход второй цепи кДНК составляет 100± 20%, причем отклонения связаны в первую очередь с ошибкой определения количества включенной метки.
Условия реакции суммированы в табл. 2. Сама реакция значительно отличается от аналогичной реакции, описанной в гл. 2, — в ней для частичной деградации РНК в дуплексе РНК—ДНК применяется РНКаза Н. Получающиеся в результате олигорибонуклеотиды служат затравками для синтеза второй цепи. Кроме того, отсутствует стадия обработки нуклеазой S1. Длину кДНК, образующейся в реакциях синтеза первой и
Таблица 2. Синтез второй цепи кДНК
1. К 28 мкл продукта синтеза первой цепи кДНК добавьте 25 мкл четырехкратного буфера для ДНК-полимеразы1); 2,5 мкл пятикратного d(ACGT)TP2); 1,0 мкл 15 мМ p-NAD (Sigma); 10 мкКи [32P]dGTP. Добавьте •5 ед. ДНК-лигазы3), 30 ед. ДНК-полимеразы I Е. coli4> и 1 ед. РНКазыН5> на 1 мкг кДНК. Добавьте такое количество воды, чтобы конечный объем реакции составил 100 мкл.
.2. Отберите две аликвоты по 2 мкл для определения общей внесенной радиоактивности и «нулевого» включения, как описано в разд. 2.1. Проинкубируйте смесь 1 ч при 14 °С, затем 1 ч при комнатной температуре.
3. Отберите аликвоту (2 мкл) для определения включенной в ДНК радиоактивности и добавьте 5 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8,0, 2 мкл 10%-ного SDS, -50 мкл фенола (уравновешенного 100 мМ трис-НС1 pH 8,0) и 50 мкл хлороформа. Встряхните пробирку для образования эмульсии и отцентрифугируйте 1 мин на микроцентрифуге. Экстрагируйте органическую фазу еще раз ¦50 мкл ТЕ.
4. К объединенным водным фазам добавьте 150 мкл 4 М ацетата аммония и 600 мкл этанола. Охладите до —70 °С в смеси сухого льда с этанолом. Далее следуйте указаниям пунктов 6 и 7 табл. 1. кДНК можно также осадить, добавив 1/10 объема 3 М ацетата натрия (профильтрованного через нитроцеллюлозный фильтр) и 2 объема этанола. Выход кДНК в этом случае может оказаться выше.
') Для получения 1 мл четырехкратного буфера для ДНК-полимеразы смешайте -400 мкл I М HEPES pH 7,6; 16 мкл I М MgCI2; 4,4 мкл 2-меркаптоэтанола; 270 мкл
1 М КС1 и 310 мкл воды.
s) Состав d(ACGT)TP приведен в примечании к табл. 1.
s) 1 единица ДНК-лнгазы Е. coli — это количество фермента, достаточное для 50%-ного лигирования расщепленной ШпАШ ДНК фага % за 30 мин при 16 °С в объеме 20 мкл и при концентрации 5'-концов 0,12 мМ (—330 мкг/мл). Авторы используют лигазу фирмы New England Biolabs.
4) 1 единица ДНК-полимеразы Е. coli — это количество фермента, необходимое для включения 10 нмолей дезоксирибонуклеотидов в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37 °С. Авторы используют фермент фирмы New England Biolabs.
5) 1 ед. РНКазы Н гидролизует 1 нМ [3Н]ро1уА в составе [3Н] poly (А): poly(dT) за 20 мин прн 37 °С. Авторы используют РНКазу Н фирмы Bethesda Research Laboratories.
M A'l А2 I.i L2 м
Ь.ОУ 5.35 J.l i: ¦
Рис. 1. Аликвоты, взятые из реакций синтеза первой и второй цепей (по 5000 имп/мин), после добавления 2 мкг ДНК-носителя осаждали этанолом, высушивали и растворяли в 20 мкл буфера для щелочного гель-электрофореза (30 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). После добавления смеси глицерина и бромкре-золового зеленого образцы фракционировали в 1,2%-ном щелочном агарозном геле в том же буфере в течение 3 ч при 150 В (с рециркуляцией буфера), отпечатывали на бумаге Whatman DE81, высушивали и радиоавтографировали. А — кДНК атриальной железы Aplysia\ L — кДНК гипоталамуса обезьяны. Цифры 1 и 2 обозначают реакции синтеза первой и второй цепей. Как упомянуто в тексте, количество метки, включаемой при синтезе второй цепи, служит количественной характеристикой этой реакции; М — дорожка стандартов длины, содержащая 5000 имп/мин расщепленной #mdIII ДНК Ad2, меченной по концам киназой. Две выделяющиеся на фоне гетерогенных продуктов реакции в дорожке А1 полосы соответствуют ДНК-транскриптам двух мРНК, кодирующих богато представленные предшественники нейропептидов, называемые А и В [16]. Качество продукта синтеза второй цепи наглядно выявляется при сравнении дорожек А1 и А2.
