Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
23. Wahl G. M„ Stern М., Stark G. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3683 (1979)
24 Suggs S. V., Wallace R. B., Hirose T„ Kawashima E. H., Itakura K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613 (1981).
25 Houghton М., Stewart A. G., Doel S. M„ Emtage J. S., Eaton M. A. W„ Smith J. C„ Patel T. P., Lewis H. М., Porter A. G., Birch /. R„ Cartwright Т., Carey N. H. Nucleic Acids Res., 8, 1913 (1980).
26. Maizels N. Cell, 9, 431 (1976).
27. St. John T. P., Davis R. W. Cell, 16, 443 (1979).
ГЛАВА 3
ЕЩЕ ОДНА МЕТОДИКА СИНТЕЗА ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ кДНК ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В ФАГОВЫХ И ПЛАЗМИДНЫХ ВЕКТОРАХ
Кристин Дж. Уотсон и Джеймс Ф. Джексон
1. Введение
В этой главе описывается еще один метод синтеза двухцепочечной кДНК, пригодной для клонирования в различных векторах. В его основе лежит новый способ синтеза второй цепи кДНК, предложенный Окаямой и Бергом [1] для клонирования кДНК в плазмидах. Традиционный метод подразумевает обработку гибрида мРНК — кДНК (продукта реакции синтеза первой цепи) щелочью для расщепления РНК. Затравкой для синтеза второй цепи в этом случае служит «шпилечная» структура, находящаяся на З'-конце молекулы кДНК [2]. Эта структура, а также те 5'концевые участки первой цепи, которые не были скопированы при синтезе второй цепи (и остались одноцепочечными), удаляются для последующего присоединения линкеров путем обработки нуклеазой S1 из Aspergillus oryzae. В нашей методике продукт реакции синтеза первой цепи не обрабатывается щелочью, а используется как субстрат для обработки РНКазой Н, ДНК-полимеразой I Е. coli и ДНК-лига-зой Е. coli в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. РНКаза Н, внося в РНК одноцепочечные разрывы, образует фрагменты-затравки, подобные фрагментам Оказаки, которые и служат субстратом для замещения РНК на ДНК (с участием ДНК-полимеразы I). ДНК-лигаза Е. coli способна «зашивать» одноцепочечные разрывы, но в отличие от ДНК-лигазы Т4 не может лигировать молекулы двухцепочечной кДНК друг с другом (при этом могли бы образоваться артефактные кДНК). Двухцепочечная кДНК после присоединения линкеров и образования липких концов при помощи рестриктазы пригодна для клонирования в векторах, предназначенных для скрининга как зондами на основе нуклеиновых кислот, так и антителами. Подробно изложенная ниже методика должна представлять интерес для большого числа исследователей. Она описывает получение двухцепочечной кДНК с fcoRI-концами, пригодной для клонирования в высокоэффективных векторах на основе фага X. В недавно появившейся работе [3] независимо описана сходная методика.
Векторы, принимающие вставку в область иммунности, такие, как NM607 [8], NM1149 [4], Xgt 10 (см. гл. 2) и Харон 7 или Харон 16 [5], предназначены для клонирования молекул с ?соРI-концами. Харон 7 и NM1149 пригодны также для кло-
108
Глава 3
нирования фрагментов ДНК, полученных при расщеплении #mdIII. Скрининг получаемых в этих векторах библиотек обычно проводят зондами на основе нуклеиновых кислот. По нашим данным и данным других авторов [6] эффективность клонирования в них превышает 2* 107 бляшкообразующих единиц (б.о.е.) на 1 мкг двухцепочечной кДНК. Такая высокая эффективность объясняется, по нашему мнению, тремя главными факторами.
1. Методы упаковки in vitro позволяют вводить геном фага в бактерию с эффективностью 1%, т. е. намного эффективнее, чем при трансформации плазмидами.
2. Так как нерекомбинантные (т. е. лигировавшиеся на себя) молекулы вектора можно устранить из библиотеки селекцией на штамме NM514 (дефектном по рестрикции производном РОР/ус7 [7]) или эквивалентном ему Hflk, (гл. 2), нет необходимости дефосфорилировать вектор. Лигирование вектора с двухцепочечной ДНК можно проводить при избытке молекул вектора. Это позволяет присоединить с двух концов плечи вектора (что необходимо для упаковки in vitro) к большинству молекул кДНК- Детальное описание этих векторов можно найти в работе [8] и гл. 2 этой книги.
3. Описанный здесь метод позволяет получать кДНК с довольно большим выходом. Выход продукта при синтезе второй цепи обычно составляет 100%. Кроме того, отсутствуют потери, связанные с обработкой нуклеазой S1. С помощью этой методики получают кДНК, пригодные и для клонирования в «экспрессирующих» векторах на основе фага (см. гл. 2) или плазмид [9, 10]; скрининг таких библиотек можно вести при помощи антител. В этих случаях, однако, вектор обычно дефосфорили-руют, что позволяет уменьшить загрязнение библиотеки нерекомбинантными молекулами.
2. Синтез кДНК
Изложенные в этом разделе методики можно использовать вместо тех, которые приведены в разд. 2.5.1—2.5.8 предыдущей главы. Методические тонкости, о которых шла речь в тех разделах, в равной степени относятся к настоящим методикам. Особенно важно использовать для всех реакций силикониро-ванные приборки. Процедура силиконирования заключается в том, что стакан с пробирками помещают в вакуумный эксикатор вместе со стаканом, наполненным силиконирующим реагентом, и выдерживают в условиях вакуума несколько часов. Авторы используют диметилдихлорсилан, поставляемый фирмой BDH в виде 2%-ного раствора в 1,1,1-трихлорэтане. Затем пробирки следует промыть стерильной дистиллированной водой и проавтоклавировать.
