Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
находящиеся на нужном расстоянии друг от друга cos-последо-вательности расщепляются и получившиеся линейные (зрелые) геномы фага X упаковываются. Переходу к механизму «катящегося кольца» мешает действие экзонуклеазы V, продукта генов гесВ и recC Е. coli. Конкатенированная ДНК все же образуется в клетках гесВС+, если фаг содержит функциональный ген gam. Продукт гена gam, появляющийся вскоре после инфекции, связывается с экзонуклеазой V и подавляет ее нуклеолити-ческую активность (но не всегда способность этого фермента участвовать в генетической рекомбинации).
46
Глава 1
ДНК-субстрат
гесА+ гесА+ sbcA red+ red"
^ sbcB+ ^ 1 \ f
Интермедиат _| Интермедиат sbcA+
recF+ | sbcB _|_recBC~
1 J_recF- recBC f
t '
ДНК-продукт [
Пути рекомбинации RecF RecBC RecE Red
Рис. 9. Обсуждающиеся в тексте пути рекомбинации (модель и рисунок основаны на данных работы [21]). Путь рекомбинации RecBC является доминирующим (99%) у Е. coli К12 дикого типа. Штаммы гесВ~, гесС~ или гесВ~гесС~ (гесВС~) дефектны по этому пути. Появление в любом из этих штаммов мутации sbcB~, по-видимому, блокирует переход RecF-пути на путь RecBC, при этом продукт recF способен эффективно катализировать рекомбинацию (~50% от уровня дикого типа). У штаммов гесА~, дефектных по обоим этим путям, рекомбинация выражена слабее всего (10_3—10_6 от уровня дикого типа). RecE — независимый рекомбинационный путь. Способность осуществлять рекомбинацию этого типа появляется в результате мутации sbcA~. С точки зрения биохимии и генетики путь RecE по многим признакам напоминает путь рекомбинации Red, характерный для фага % дикого типа. Причина этого заключена в том, что ген гесЕ содержится в дефектном ^.-подобном профаге,, присутствующем в хромосоме большинства штаммов Е. coli К.12. В норме ген гесЕ (так же, как и гены red профагов Я) репрессирован. Мутация sbcA~, картируемая вблизи гесЕ, каким-то образом активирует этот ген. Продуктами recBC+, sbcB+ и recE+ ( = sbcA~) являются соответственно эндонуклеазы V-
1 и VIII.
Все описываемые здесь векторы имеют генотип gam+. Следует отметить, однако, что для увеличения максимальной длины вставки и для того, чтобы появилась возможность генетической селекции против нерекомбинантных фаговых частиц при высеве библиотеки (разд. 14), содержащейся в исходных векторах типа EMBL ген gam при получении рекомбинантных производных приходится приносить в жертву (рис. 8). Тем не менее gam--рекомбинанты могут размножаться в гесВС+-хозяине, если подвергаются в нем молекулярной рекомбинации с образованием-ди- или мультимерных (и, следовательно, конкатенированных) молекул ДНК (рис. 7). Кодируемые геномом фага ферменты рекомбинации (Red) не могут участвовать в этом процессе, так как гены red обычно расположены в геноме % рядом с геном gam (рис. 6), и также утрачиваются при удалении центрального
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК__________47
фрагмента. Следовательно, жизнеспособность рекомбинантов redr gam- определяется системой рекомбинации хозяина (Rec).
Если хозяин гесА+ и одновременно гесВС+, то рекомбинация, как ни странно, происходит через систему RecBC с участием экзонуклеазы V (разд. 16.2 и рис. 9). Подходящим субстратом для рекомбинации через систему RecBC будут только те молекулы фаговой ДНК, которые содержат одну или более копий октануклеотидной последовательности, обозначаемой Chi [1]. Фаг К дикого типа не содержит последовательностей Chi (система Red не зависит от Chi). Для того чтобы рекомбинантные производные векторов EMBL можно было размножать в гесВС+-хозяине, (таком, например, как лизоген Р2, разд. 14), в ДНК плеч этих векторов введена Chi-последовательность. Некоторые векторы замещения, например Харон 4, Харон 4а и Харон 30 [1, 2, 4, 5], после удаления центрального фрагмента приобретают генотип gam~Chi~, и, следовательно, рекомбинанты, содержащие в донорном фрагменте Chi-последовательность, будут значительно обгонять в росте не имеющие этой последовательности клоны. Следовательно, описанные векторы можно рекомендовать для конструирования представительных библиотек только в том случае, если эти библиотеки получают и ампли-фицируют на гесВСохозяине. Рекомбинанты векторов Харон 34 и Харон 35 (рис. 8) имеют генотип gam+ (и redr) и не нуждаются в Chi-последовательности.
13.2. Факторы, влияющие на размер бляшек
Для эффективной адсорбции фага К на внешней мембране Е. coli должен присутствовать кодируемый геном 1атВ рецепторный участок. Присутствие ионов магния облегчает адсорбцию. Погибшие клетки и даже их обломки также способны сорбировать фаг, вот почему следует избегать работы с культурами, находившимися продолжительное время в стационарной фазе и содержащими значительный процент мертвых клеток.
