Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
14. Селекция против родительских фагов
Фаги gam+ не способны формировать бляшки на Е. coliu лизогенной по фагу Р2 (см. [1]). Этот, хотя и не вполне понятный, феномен можно обратить на пользу, вставив функциональный ген gam в центральный фрагмент вектора, который не содержал этого гена. Таким образом и сконструированы векторы EMBL3 и EMBL4 (разд. 15). При работе с ними нет необходимости перед лигированием плеч вектора с донорными фрагментами удалять (либо каким-то образом инактивировать) центральный фрагмент. Хотя среди продуктов лигирования будут присутствовать родительские (gam+) геномы, их рост будет эф-
4-196
:S0
Глава 1
фективно подавляться при размножении библиотеки на штамме Е. coli (Р2). Формировать бляшки на таком газоне могут только рекомбинантные (gam~) фаговые частицы.
Чувствительность к мешающему влиянию Р2 (фенотип Spi+, от англ. sensitivity to Р2 interference) объясняется, по крайней мере отчасти, инактивацией нуклеазы recBC Е. coli продуктом гена gam фага К (разд. 13.1). Фаг Р2 не способен лизогенези-ровать штаммы гесВС~. Поэтому инфекция лизогена Р2 gam+ (но не gam~) фагом К приводит к прекращению репликации ДНК и синтеза белка. Фаг К gam- (и одновременно Chi+) способен расти на лизогенном по Р2 хозяине, однако более крупные бляшки получаются в том случае, если фаг будет также и red~ (дефектен по рекомбинации). Говорят, что фаг red~ gam~Chi+ имеет фенотип Spi~, так как он нечувствителен к действию профага Р2. Какую роль в образовании фенотипа играет ген red, не известно, однако фенотип Spi~ широко используется для отбора red- gam--npou3водных СЫ+-фагов. Отбор 5р1~-фенотипа лежит в основе селекции рекомбинантных производных СЫ+-векторов замещения (например, EMBL3 на рис. 8), у которых центральный (замещаемый донорным) фрагмент содержит гены red и gam фага К.
15. Выбор вектора замещения
Мы рассмотрим здесь только те векторы, которые могут использоваться для клонирования в сайтах BamHl донорной ДНК, рестрицированной Sau3A. Такие векторы позволяют отделять клонированные последовательности от плеч (рис. 8). После расщепления ?coRI эти же векторы могут применяться, хотя и с меньшим эффектом, и для клонирования полученной механическим дроблением смеси случайных фрагментов ДНК после присоединения к ним fcoRI-линкеров. Более того, все приведенные на рис. 8 векторы можно использовать для клонирования фрагментов, образующихся после рестрикции донорной ДНК другими ферментами (для EMBL3, например, это jEcoRI, jEcoRI*, BamHl, Bglll, Bell, Xholl, Sail, Xhol и один из типов фрагментов, образующихся при действии Aval), хотя в большинстве случаев при этом нельзя получить представительной библиотеки.
Полилинкеры векторов EMBL3 и EMBL4 [6] ориентированы в противоположных направлениях, в остальном же векторы одинаковы. В обоих можно клонировать фрагменты длиной 9—22 т. п. н., и, так как их рекомбинантные производные, обладающие фенотипом Spi~ (разд. 14), можно отбирать генетически в лизогенах по Р2, удалять центральный фрагмент в таких векторах нет необходимости. Простой биохимический метод .инактивации центрального фрагмента EMBL3 (разд. 3.4) на-
_____Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК_51
столько эффективен, что до 98% способных к упаковке молекул при его применении представляют собой рекомбинанты. При использовании этого метода или при физическом удалении центрального фрагмента нет необходимости в применении Р2-лизо-генов, для которых характерен генотип гесА+ и гесВС+, и, следовательно, есть возможность селективно выделить red~ gam~-рекомбинанты в условиях Rec~ (разд. 16.2). В центральном фрагменте обоих векторов имеются два сайта для Sail. Расщепление вектора EMBL4 одновременно рестриктазами ВатШ и Sail, хотя и не позволяет ферментативно инактивировать центральный фрагмент (см. разд. 3.4), повышает разрешение при; удалении этого фрагмента. Подробные рестриктные карты EMBL3 и EMBL4 можно найти в приложении к работе [1].
Векторы Харон 34 и Харон 35 [8] отличаются только центральными фрагментами и позволяют клонировать вставки длиной 9—20 т. п. н. Эти векторы содержат полилинкеры с большим числом участков рестрикции, чем EMBL3 и EMBL4, а их рекомбинанты имеют генотип gam+ и способны расти на любом. Кес~-хозяине. При использовании этих векторов необходимо* однако, перед лигированием с донорными фрагментами отделить плечи векторов от центрального фрагмента. Центральный фрагмент вектора Харон 35 содержит два сайта для ВатШ, что-упрощает выделение ДНК его плеч. Подробные карты этих векторов приведены в работе [8]. В правом плече векторов Харон 34 и Харон 35 имеется дополнительный сайт узнавания (рис. 8), однако данные векторы все-таки можно использовать для клонирования по Sail, так как при расщеплении этим ферментом потери необходимой для развития фага ДНК не-происходит.
Отдельно следует рассмотреть вопрос о выборе вектора для клонирования ДНК позвоночных и растений. В этих ДНК относительно редко встречается динуклеотид 5'-CG-3', лежащий в середине последовательности, узнаваемой Sail (GTCGAC). Поэтому сайты рестрикции Sail в этих ДНК встречаются реже, чем следовало бы ожидать. Если такую ДНК клонировать в векторе, сайты ВатШ которого соседствуют с сайтами для Sail (например, в векторе EMBL3), то, обрабатывая рекомбинантную молекулу ДНК рестриктазой Sa/I, можно вырезать вставку, расщепленную на сравнительно небольшое число фрагментов (в случае удачи — в виде одного фрагмента). После этого нетрудно субклонировать вставку в сайте Sail плазмидного вектора.
