Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Использование ^.-векторов для конструирования библиотек ДНК 55
сти следует использовать хозяина стенотипом recA~recBC~sbcB~, однако при этом помнить, что выход фаговых частиц будет невысок.
17. Фаг X или космида!
Главное достоинство космидного вектора [2, 23, 24] при конструировании геномных библиотек — это большая длина клонируемых фрагментов ( — 45 т. п. н). Преимущество таких векторов состоит не в несколько меньшем числе рекомбинантов, образующих представительную библиотеку (табл. 1), а в том, что «прогулка по геному» предполагает меньшее число шагов. Кроме того, некоторые особенно длинные гены эукариот могут помещаться в одном фрагменте ДНК.
Еще одно преимущество космид состоит в том, что в них отсутствуют большие участки генома фага Я, которые могут ¦создать трудности при картировании ^-рекомбинантов с помощью рестриктаз. Этот недостаток отчасти уравновешивается тем фактом, что вставку длиной 45 т. п. н. картировать труднее, чем в 20 т. п. н. Еще не вполне ясно, насколько новые методы, такие, как анализ продуктов неполного расщепления (разд. 11), смогут упростить картирование фаговой ДНК, особенно если станут доступны Я-векторы, липкие концы и полилинкеры которых сближены.
Один из недостатков космидной системы состоит в том, что выход рекомбинантных молекул при ее использовании ниже, чем в случае Я-векторов. Особое значение это имеет в тех случаях, когда количество донорной ДНК ограничено. Не нужно забывать также, что для эффективного клонирования в косми-дах исходная ДНК должна обладать значительно большим молекулярным весом, чем для клонирования в фаге К.
Второй и главный недостаток космид в том, что скрининг методом гибридизации ДНК менее эффективен для них (гибридизация колоний), чем для фагов (гибридизация бляшек). Отчасти это объясняется уменьшением числа копий плазмиды при увеличении ее размера. Трудность можно обойти, используя новую космидную систему (Литтл и Кросс, в печати). Такая система (число копий плазмиды в ней не зависит от размеров вставки) менее подвержена делециям, к которым обычно склонны рекомбинантные космиды. Альтернативой для гибридиза-ционного скрининга служит недавно опубликованный метод [25] селекции космидных клонов по гомологичной рекомбинации с плазмидой, кодирующей устойчивость к дополнительному антибиотику.
В заключение отметим, что, хотя новые системы векторов разрабатываются, для их проверки и наладки требуется время.
56
Глава 1
18. Методические подробности
18.1. Среды и буферы 18.1.1. Среды на основе L-бульона
1. L-бульон Бакто-триптон (Difco) 10 г
Дрожжевой экстракт (Difco) 5 г
NaCl 10 г
Вода до 1л
Довести pH до 7,2 добавлением NaOH. Для культивирования фага X. и его производных внести 10 мМ MgS04.
2. Агар на L-бульоне. К 1 л L-бульона добавить:
Бакто-агар (Difco) 15 г
3. Верхний слой на L-бульоне. К 1 л L-бульона добавить:
Бакто-агар (Difco) или агарозу для гель-электрофореза 6,5 г
MgS04 Ю мМ
18.1.2. Среды на основе BBL-триптиказы
1. BBL-бульон Триптиказа (Baltimore Biological 10 г
Laboratories)
NaCl 5 г
Вода до 1 л
pH 7,2
2. Агар на BBL-бульоне. К 1 л BBL-бульона добавить:
Бакто-агар (Difco) 10 г
3. Верхний слой на BBL-бульоне. К 1 л BBL-бульона добавить:
Бакто-агар (Difco) или агарозу для гель- 6,5 г электрофореза
MgS04 Ю мМ
18.1.3. Буферы
1. Фаговый буфер Трис-НС1 pH 7,5 50 мМ
NaCl 100 мМ
MgS04 10 мМ
Желатина 0,02%
2. ТЕ Трис-НС1 pH 8,0 10 мМ
ЭДТА pH 8,0 1 мМ
3. SSC Хлористый натрий 0,15 М
Цитрат натрия 0,015 М.
4. Лигазный буфер (ХЮ). Трис-НС1 pH 7,5 0,675 М
MgCl2 0,1 М
Дитиотрейтол 0,15 М
Спермидин 10 мМ
АТР 10 мМ
18.2. Общие замечания
Ниже приведены общие для многих методик правила.
1. Все используемые для работы буферы, растворы, ферменты, упаковочные экстракты, препараты ДНК, буферы для нанесения на гель и т. п. должны быть по возможности свежеприго-
