Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Важно отметить, что при плотном рассеве (почти сливающиеся бляшки) условия благоприятствуют одновременному заражению некоторых бактерий (в участках перекрывания бля-
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
35
шек) более чем одним рекомбинантным фагом. Если не использовать Rec^-хозяина (разд. 16.2), это может привести к генетической рекомбинации между повторяющимися элементами, присутствующими в разных молекулах ДНК. Рекомбинация в свою очередь приводит к появлению жизнеспособных фагов, содержащих последовательности, принадлежащие разным участкам исходного генома. Особые трудности рекомбинация вызывает при клонировании донорных ДНК, несущих высокоповторяющиеся последовательности, такие, как Alu-элементы (встречающиеся примерно через каждые 10 т. п. н. в геноме человека я, следовательно, присутствующие в большом числе рекомбинантных фагов). Если скрининга с высокой плотностью в Кес+-хозяине избежать нельзя, при анализе рекомбинантов следует помнить о возможности появления фагов с отличным от исходного расположением фрагментов генома, хотя большая часть положительно гибридизующихся фагов будет все же содержать интактные неперестроенные молекулы ДНК.
Кроме напоминающих по форме бляшки пятен могут встречаться и другие виды фоновой (неспецифической) гибридизации, не удаляющиеся при интенсивной промывке. К ним относятся, например, пятна или сплошной радиоактивный фон по всему фильтру, или же значительное включение метки во все бляшки (различимые только при скрининге с низкой плотностью). Если скрининг библиотеки ведется с помощью гомологичного зонда, положительный сигнал обычно обнаруживается без труда. При использовании же гетерологичных зондов либо сложных смесей радиоактивных кДНК или мРНК могут встретиться трудности. К сожалению, единственным надежным контролем для различения сигнала и фона (а значит, для решения вопроса о присутствии или отсутствии искомой последовательности в библиотеке) служит тот рекомбинантный фаг, который требуется получить. Если при скрининге возникают проблемы, то для того, чтобы проверить, нет ли ошибок на разных стадиях методики, необходимо поставить ряд контрольных экспериментов.
1. Контроль бляшек. Если имеются рекомбинантные фаги %, гомологичные ДНК-зонду, их можно рассеять на отдельные бляшки при сравнительно низкой плотности на контрольной чашке. С этой чашки снимают реплику и используют ее для гибридизации. Такой контроль возможен, например, на всех ‘(кроме начальной) стадиях «прогулки по хромосоме» (разд. 12). Можно также получить контрольную бляшку (макробляшку), перенося зубочисткой фаг на поверхность чашки, на которой рассеяна библиотека, сразу после того, как верхний слой агара застынет.
2. Контроль зонда. Фильтры-реплики гибридизуют с зондом, содержащим последовательность ДНК, заведомо присутствующую в библиотеке. Если этот зонд содержит последов атель-
3*
36
Глава 1
ность, повторяющуюся в геноме (например, клонированный ген рибосомной РНК), то достаточно будет провести скрининг небольшой части библиотеки. Подробная методика гибридизаци-онного скрининга приведена в разделе 18.10.
10. Другие методы скрининга и селекции
Кроме наиболее часто используемого скрининга путем гибридизации с мечеными ДНК- или РНК-зондами существуют и-другие. Один из них — это метод, разработанный Брайаном Сидом с сотр. [2]. Библиотеку геномной ДНК получают, как описано выше, но с использованием вектора, несущего две амбер-мутации в необходимых для развития фага генах. Библиотекой инфицируют Rec+'Штамм Е. coli, несущий фрагмент-зонд в молекуле плазмидной ДНК. Кроме зонда эта плазмида кодирует супрессор, мутантную тРНК, способную подавлять амбер-мута-цию. Гомология между зондом и соответствующей рекомбинантной молекулой ДНК позволяет плазмиде рекомбинировать и включиться в геном фага. Несущие плазмиду фаговые частицы выделяют из лизата по их способности формировать бляшки на свободном от супрессора хозяине. Интегрированную плазмиду перед анализом и дальнейшей работой с клонированной ДНК необходимо удалить (путем эксцизионной рекомбинации). Наличие частичной (прерывистой) гомологии между зондом и донорной ДНК затрудняет решение этой задачи. Недостатком-метода является также и то, что библиотеку необходимо выращивать в способном к рекомбинации (Rec+) хозяине (разд. 16.2). Разработан вектор EMBL3a (производное EMBL3), несущий' две амбер-мутации, однако по неизвестным причинам эффективность селекции в нем [6] не достигает уровня, описанного Сидом [2] для вектора Харон 4А.
Скрининг может быть основан на экспрессии клонированных последовательностей ДНК- Используют как комплементацию^ дефектов бактерии-хозяина, так и иммунологический метод выявления полипептидов [1]. Изображенные на рис. 8 векторы замещения содержат сильные промоторы, с которых может происходить транскрипция клонированных ДНК, но не содержат элементов, обеспечивающих трансляцию мРНК. Такие методы больше подходят для генов прокариот, хотя некоторые успехи достигнуты и для генов низших эукариот.
