Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
(77 К) максимумы поглощения большинства гемопротеинов сдвигаются в
голубую область спектра (на 1-4 нм) относительно их положения при
комнатной температуре, и при этом значительно изменяются параметры полос
[4, 22]: они становятся уже и интенсивнее. Последний эффект связан как с
внутренними изменениями в экстинкции, так и с увеличением эффективной
длины оптического пути (пен той же причине, что и для мутных растворов;
см. разд. 2.4.1).
Улучшение спектральных характеристик и отсутствие химических изменений в
образце при очень низких температурах позволяет регистрировать спектры
индивидуальных компонентов сложных систем, например интактных
электронтранспортных цепей. Удивительно, что некоторые окислительно-
восстановительные реакции и обмен лигандами идут даже при 4 К, что
позволяет изучать реакции, протекающие при обычных условиях очень быстро.
Смесь исследуемых реагентов замораживают, и фотохимическим путем
индуцируют нужную реакцию [4, 23, 24].
Процессы тушения значительно более чувствительны к температуре, чем сама
флуоресценция, поэтому выход флуоресценции почти всегда возрастает с
уменьшением температуры. При 77 К интенсивность флуоресценции
флавопротеинов митохондрий увеличивается по крайней мере на порядок, что
позволяет изучать окислительно-восстановительное состояние митохондрий в
замороженных тканях флуориметрическими методами [15].
320
Глава 7
Фирменные спектрофотометры часто бывают снабжены низ-.котемпературными
приставками, обычно дорогими. Описаны также более простые самодельные
устройства [4, 23]. Мы же в своей лаборатории для регистрации сигналов
при 77 К просто ¦погружаем конец световода в жидкий азот, где находится
образец [25]. Таким образом были получены спектры отражения замороженных
почек крыс; их анализ позволил выявить дезок-сигенацию гемоглобина и
восстановление цитохрома аа3 прн •ишемии. Отметим также, что при
исследовании этих препаратов в одном и том же поле зрения обнаруживаются
и восстановленный цитохром ааг, и оксигемоглобин. Это указывает на
значительную гетерогенность данного органа с точки зрения метаболизма
(рис. 7.3).
Некоторые реакции с участием гемопротеинов можно выявить только прн
кинетических измерениях, проводимых при 4 К (температуре жидкого гелия);
к сожалению, соответствующая аппаратура имеется лишь в немногих
лабораториях.
3. Примеры
3.1. Окислительно-восстановительное состояние митохондрий in situ
Свойства суспензий интактных митохондрии всесторонне и тщательно
исследовались. С помощью двухволновой спектроскопии ([И]; разд. 2.4.1)
удалось охарактеризовать индивидуальные пигменты дыхательной цепи. Однако
всегда остается вопрос: насколько наблюдаемые свойства изолированных
препаратов соответствуют свойствам системы in vivo? Чтобы ответить на
него, можно попытаться исследовать свойства пигментов дыхательной цепи in
situ. Спектроскопические исследования изолированных тканей
анестезированных животных [25, 26] позволяют судить об окислительно-
восстановительном состоянии электронтранспортной цепи и о степени
насыщения кислородом гемоглобина/миоглобина. К сожалению, быстрые
флуктуации в скоростях доставки и потребления Ог затрудняют установление
истинных стационарных состояний. Поэтому для проведения измерений лучше
быстро заморозить ткани и проводить измерения при низких температурах - в
условиях лучшего разрешения (разд. 2.5).
На рис. 7.3 приведены спектры отражения замороженных почек крыс,
полученные следующим образом.
1. Удаляли почки у анестезированного животного и быстро их
замораживали, зажав в охлажденных до 77 К щипцах из алюминия [27].
Оптическая спектроскопия биологических мембран
321
2. Замороженные ткани хранили при 77 К и регистрировали спектры с
поверхности с помощью раздвоенного световода (рнс. 7.1), конец которого
охлажден до 77 К и подходит вплотную к замороженной ткани.
Были зарегистрированы спектры трех разных препаратов почек: естественно
перфузированной и почек, у которых была вызвана ишемия путем наложения
лигатуры на почечную артерию, а затем - через 1 мин и 10 мин - они были
заморожены в жидком азоте. Спектр отражения ткани в видимой области
обусловлен в основном поглощением оксигемоглобина (^тах=542 и 577 нм),
гемоглобина (/,тах=555 нм), ферроцито-хромов аа3 (Ятах = 605 нм) и с
(Z,max = 550 нм). Избыток гемоглобина в ткани приводит к тому, что в
суммарном спектре полосы поглощения ферроцитохромов имеют вид плеча, а не
четкого максимума. В спектре нормальной почки (кривая 1) присутствуют
только полосы поглощения оксигемоглобина, что говорит о полноценном
снабжении ткани кислородом и полноценном митохондриальном дыхании. Через
1 мин после наложения лигатуры (кривая 2) содержание оксигемоглобина
сильно падает н в спектре появляются плечи при 605 и 550 нм, что
указывает на восстановление митохондриальной дыхательной цепи сразу после
прекращения поступления кислорода. Спектр, снятый через 10 мин после
наложения лигатуры, идентичен спектру, снятому через 1 мин; разность этих
