Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
калибровки сигнала ие сдвигать образец с места.
4. Меняя pH среды в присутствии моненсина, проводят калибровку сигнала
(см. рис. 7.8,А).
вести к удалению также и внутриклеточного красителя, особенно если
имеется небольшая "утечка". Было показано, что оптимальная процедура
состоит в непродолжительном высокоскоростном центрифугировании клеток на
микроцентрифуге, быстром их ресуспендировании и проведении калибровки
[8].
4. После установления стационарного состояния можно подвергать клетки
действию тех или иных агентов и наблюдать за изменениями флуоресценции.
5. Проводят калибровку сигнала флуоресценции (рис. 7.8, Б, В). Для этого
с помощью дигитонина или тритона Х-100 делают клетки проницаемыми (если
измеряется pH - в присутствии 0,5 мМ ЭГТА и 0,5 мМ ЭДТА, хелатирующих
ионы металлов, которые являются сильными тушителями флуоресценции), а
затем титруют суспензию ионами Н+ или Са2+ до тех пор, пока не будет
наблюдаться такая же интенсивность флуоресценции, что и без детергента.
Несколько слов о мерах предосторожности при мытье кювет: хромовая смесь
может содержать тушители флуоресценции. Избавиться от них можно, просто
сполоснув кювету раствором какого-либо хелатирующего агента, например
ЭДТА.
К сожалению, некоторые клетки, по-видимому, не могут удерживать очень
долго кислые формы таких pH- и Са2+-инди-каторных красителей, даже если
мембрана непроницаема для свободной кислоты. Поэтому очень важно
проверить, действительно ли наблюдаемая флуоресценция связана с
содержимым клеток. Лучше всего это сделать, осадив часть суспензии и про-
Оптическая спектроскопия биологических мембран
333
Таблица 7.4. Окрашивание цитоплазмы с помощью ацетокснметиловых эфиров
Са2+- или pH-чувствительных индикаторных красителей
1. Готовят 10 мМ раствор ацетоксиметилового эфира красителя квин-2 (для
измерения концентрации Са2+) или квен-1 (для измерения pH) в ДМСО.
2. Инкубируют клетки при 37 СС в изотоническом забуфереином
физиологическом растворе н добавляют 10 мМ раствор индикатора до
концентрации примерно 1-5-10-6 М (-0,1-0,5 нмоль индикатора/106 клеток).
Конечная концентрация ДМСО менее 0,5% (по объему).
3. За ходом гидролиза эфира следят по спектрам флуоресценции суспензии
клеток. При появлении свободной кислой формы максимум флуоресценции
красителя сдвигается в голубую область (более короткие длины волн) [8,
9].
4. После достижения степени гидролиза 80% или более (обычно через 30- 90
мин) клетки осаждают центрифугированием; осадок ресуспендируют в среде
без красителя и инкубируют еще 30 мин при 37 °С.
5. Осаждают клетки еще раз и ресуспендируют в среде для проведения
флуоресцентных измерений.
6. Меняя pH или концентрацию Са2+ в среде, как показано на рис. 7.8, Б,
В, калибруют сигнал флуоресценции.
Если окрашивание цитоплазмы происходит медленно, в среду для инкубации
добавляют бикарбонат. Это позволяет поддерживать pH внутри клеток вблизи
7 - условия, при которых активность цитоплазматических эстераз
максимальна.
верив, содержит ли супернатант краситель (контроль на флуоресценцию
супернатанта). Если утечка все же происходит, разумные данные можно
получить, проинкубировав клетки с эфиром красителя лишь очень недолгое
время (значительно меньшее, чем нужно для полного гидролиза эфира),
быстро отмыв клетки и немедленно проделав описанные выше процедуры по
определению pH или концентрации Са2+. К сожалению, это приводит к
неизбежному увеличению расхода довольно дорогого исходного материала.
С помощью проникающих индикаторов можно измерить pH цитоплазмы только при
условии, что вклад во флуоресценцию, вносимый внеклеточным красителем,
соответствующим образом компенсирован. Для такой цели лучше всего
подходит нейтральный красный. Он легко проникает внутрь клетки, а если pH
среды достаточно стабилен, любые изменения интенсивности флуоресценции
можно отнести к изменениям pH в замкнутом компартменте [36]. На рис. 7.9
показаны результаты типичного эксперимента по измерению абсолютного
значения внутриклеточного pH с помощью нейтрального красного.
Эксперименты проводят по следующей схеме.
1. Инкубируют клетки (в данном случае используется так называемая
линия Леттре клеток асцитной опухоли) в содержащем HEPES физиологическом
растворе в присутствии 0,025 мМ нейтрального красного при комнатной
температуре (при концентрации 5-10е клетка/мл примерно 50% красителя
ассоциировано с клетками) и записывают спектр (спектр 1).
334
Глава 7
2. Осаждают клетки и регистрируют спектры поглощения супернатанта (спектр
2). Спектр 3 - разность двух первых спектров - представляет собой спектр
ассоциированного с клетками красителя.
3. Вычисляют pH в каждом компартменте по стандартной калибровочной
кривой, полученной с помощью спектров растворов нейтрального красного с
известными значениями pH.
В качестве параметра было выбрано отношение поглощения кислой формы
красителя (Л53о) к поглощению в изобестической точке (Л477), поскольку
оно подчиняется уравнению Гендерсо-на - Хассельбальха и не зависит от
