Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
задачи. Если имеются в виду внутренние, эндогенные хромофоры, это
означает выбор такого объекта, в котором данный хромофор присутствует и
ведет себя соответствующим образом. Например, каротиноидные пигменты
реагируют на мембранный потенциал, генерируемый на свету в ходе реакций
фотосинтеза. Такие пигменты содержатся во многих фотоспнтетических
мембранах, но их использование в роли "молекулярных вольтметров" легче
всего продемонстрировать на препаратах, известных под названием
"хроматофо-ры", из некоторых фотосинтетических бактерий, например Rho-
dobacter sphaeroides и Rhodobacter capsulata. Для изучения потребления и
транспорта кислорода in vivo необходимы богатые кровеносными сосудами
ткани, содержащие большое количество митохондрий, например мозг, печень
или сердечная мышца (правда, в последнем случае практически невозможно
отделить вклад миоглобина от вклада гемоглобина). Во всех этих случаях,
однако, переносчики кислорода, как правило, оптически маскируют
митохондриальные пигменты, концентрация которых в тканях значительно
меньше.
Выбор экзогенных хромофоров определяется в основном тремя факторами.
2.2.1. Доставка хромофора и месту назначения
Большинство оптических зондов, используемых для изучения мембран,
представляют собой липофильные соединения и могут храниться в виде
концентрированного раствора в таких растворителях, как этанол или
диметилсульфоксид. Этот раствор разбавляют по крайней мере в 200 раз
мембранным препаратом, и краситель диффундирует к месту назначения.
Подобное мечение неспецифично, и в случае мультимембранных систем,
например интактных клеток, зонды неравномерно распределяются между
различными компартментами. Это хорошо, если краситель концентрируется в
интересующей исследователя области (например, цианиновые красители
концентрируются в митохондриях [5], а слабые основания - в эндосомах с
кислым содержимым [6, 7]). Однако, если нужно измерить pH цитоплазмы
(разд. 3.3.2) или потенциал на плазматической мембране (разд. 3.2.2), то
прежде чем использовать такие
314
Глава 7
красители, необходимо провести соответствующие измерения, которые
позволили бы учесть присутствие красителей в других компартментах клетки.
Специфичность мечения удается немного повысить, используя неактивные
производные красителей (обычно их эфиры), которые локально переходят в
активную форму с помощью эндогенных эстераз. Такой методический подход
применяли для оценки содержания в цитоплазме Са2+ и Н+ с помощью
флуоресцирующих аналогов ЭДТА [8, 9]. Специфичность достигается тем, что
активные эстеразы локализируются исключительно в изучаемом компартменте
(разд. 3.3.2).
Специфическое мечение можно осуществить, ковалентно пришив хромофор к
какой-либо молекуле-носителю, обычно иммуноглобулину или гормону, который
избирательно связывается с клеточным рецептором.
2.2.2. Конкуренция с эндогенными пигментами
Мембраны содержат компоненты, которые поглощают свет в ближней УФ-области
и сильно рассеивают голубой свет. Поэтому обычно удобнее использовать
зонды с максимумом флуоресценции или поглощения в красной области
спектра. Напомним, однако, что многие фотометры менее чувствительны к
красному свету, чем к синему, поэтому преимущества, получаемые при работе
с красителем, оптические характеристики которого не столь близки к
характеристикам природных пигментов, в значительной мере нивелируются
уменьшением чувствительности аппаратуры. Флуоресценция экзогенных зондов
сильно тушится, если их спектр испускания перекрывается с интенсивной
полосой поглощения эндогенных хромофоров. Клетки флуоресцируют в желто-
зеленой области спектра (вероятно, благодаря наличию флавинов), что
затрудняет использование хромофоров на основе флуоресцеина. Кроме того,
наблюдается слабая флуоресценция клеток в красно-оранжевой области,
спектр которой перекрывается со спектром флуоресценции производных
родаминового ряда. При благоприятных условиях изменения флуоресценции
обнаруживаются даже в тех случаях, когда изменение поглощения маскируется
поглощением эндогенных пигментов [10].
2.2.3. Токсическое действие хромофоров
Нетоксичные при низких концентрациях хромофоры, накапливаясь в
определенных компартментах, могут становиться мощными ингибиторами. Так,
цианиновые красители сильно подавляют дыхание в пункте I сопряжения
дыхательной цепи
Оптическая спектроскопия биологических мембран
315
митохондрий прн условии, что потенциал на внутренней митохондриальной
мембране достаточно велик (отрицателен внутри) [11]. В живых клетках
потенциал внутренней мембраны митохондрий составляет около 180 мВ, а
потенциал плазматической мембраны - около 60 мВ (оба отрицательны
внутри), и при концентрации цианина в среде 10-7 М электрохимическое
равновесие устанавливается, когда его концентрация в матриксе митохондрий
достигает величины 10_3 М. Таким образом, даже очень низкие концентрации
цианиновых красителей могут отрицательно сказаться на клеточном дыхании н
