Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
следует, поскольку альбумин свяжет весь оксонол, и краситель не сможет
взаимодействовать с клетками). После установления равновесия (через "10
мин) поглощение суспензии стабилизируется.
2. В этот момент добавляют валиномицин, под действием которого
трансмембранный потенциал смещается в сторону равновесного значения К+-
потенцнала [определяемого уравнением (!)]¦ Поглощение оксонола прн этом
соответствующим образом изменяется. В целых клетках запас К+ весьма
велик, и потенциал в присутствии оксонола и валиномицина, по-видимому,
довольно стабилен. Когда равновесный К+-потенциал становится равен
мембранному, добавление валиномицина не сказывает-
Рис. 7.6. Измерение мембранного потенциала клеток Леттре с помощью оксо-
иола-iV. А. 5 -106 клеток/мл суспендировали в 5 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, в
присутствии 2,2-10~6 М оксонола-V; pH доводили до 7,4 раствором NaOH при
33 °С. Среда содержала также КС1 (конечная концентрация указана над
кривыми) и NaCI (столько, чтобы суммарная концентрация КС1 и NaCI
составила 155 мМ). Добавляли валиномицин до концентрации 1 -10-6 г/мл
(указано стрелками). Записи кинетики четырех отдельных экспериментов
совмещены так, чтобы сигналы перед добавлением валиномицина совпадали.
Концентрация К+ в среде, при которой валиномицин не вызывает изменений
поглощения, была получена путем интерполяции и составила 7,1 мМ;
внутриклеточная концентрация К+ равна 73,3 мМ. Отсюда, используя
уравнение (2), можно вычислить трансмембранный потенциал, равный в данных
условиях - 62 мВ. Б. 5-10_6 клеток Леттре в 1 мл суспендировали в среде,
содержащей 150 мМ NaCI, 5 мМ КС1, 5 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 2,2-10_6 М
оксоиол-V; pH доводили раствором'NaOH до 7,4 при 33 СС. Время добавления
валиномицина (1-10-6 г/мл) и КС1 (концентрации указаны над кривыми)
отмечено стрелками. Концентрация К+ в среде, при которой валиномицин не
приводит к изменениям поглощения, равна 6,9 мМ, концентрация К+ в
цитоплазме - 63,3 мМ, а потенциал плазматической мембраны -60 мВ. (Из
работы [21] с разрешения авторов.)
Оптическая спектроскопия биологических мембран
327
ся на потенциале, а следовательно, не изменяется и поглощение красителя.
Это так называемая "нулевая точка" по К+ [34]; подставив в уравнение (1)
значения концентрации К+ в среде и в цитоплазме ([К+]н и [К+]в), мы
получим значение трансмембранного потенциала. Коль скоро валиномицин
влияет на потенциал в используемых условиях, нулевая точка по К+ может
быть получена любым из двух представленных на рис. 7.6 способов.
3. После добавления к клеткам валиномицина и установления нового
равновесного состояния увеличивают концентрацию К+ в среде добавлением
небольших порций концентрированного КС1 (4М, по-видимому, наиболее
удобная концентрация; рис. 7.6).
4. Измеряют поглощение при нескольких значениях концентрации
внеклеточного К+ и путем интерполяции получают нулевую точку. Обычно для
этого достаточно просто продолжить соответствующую кривую на глаз, не
прибегая к методу наименьших квадратов, особенно если теоретическая
Зависимость поглощения красителя от потенциала неизвестна. v
При такой постановке эксперимента для определения потенциала нужна только
одна проба с образцом, что позволяет сэкономить время и дорогостоящие
препараты. Альтернативная постановка опыта состоит в инкубации клеток в
среде с разной концентрацией К+ и в регистрации изменений в ответ на
добавление валиномицина (рис. 7.6). Нулевую точку по К+ тоже получают
путем интерполяции. Этот способ можно использовать только для клеток с
довольно низкой проницаемостью для К+; клетки с более высокой
проницаемостью деполяризуются вереде с большим содержанием этого иона и
последующее добавление валиномицина уже почти ничего не меняет. При любой
постановке эксперимента для получения точной оценки потенциала необходимо
знать концентрацию К+ в цитоплазме. Для этого осаждают клетки через
смесь, содержащую ди-н-бутил-фталат (две части) и динонилфталат (одна
часть) с плотностью 1,02; в такой среде клетки осаждаются после
центрифугирования в микроцентрифуге В (Beckman) в течение 10 с.
Концентрацию катионов в клетках определяют (предварительно оценив
содержание воды; влажный вес минус сухой вес) с помощью атомной
абсорбционной спектроскопии. Количество среды, просочившейся в осадок
клеток, обычно составляет менее 0,05%, но и его можно контролировать,
добавив в инкубационную среду какой-либо внеклеточный маркер, например
[14С]-инсулин.
Существует опасность, что липофильный комплекс валино-мицин/К+ будет
связывать липофильные анионы, например ок-сонольные красители, поэтому
описанную выше калибровкуже-
22*
328
Глава 7
лательно провести с другим ионофором. Для этого полезен разобщитель ФКФ,
избирательно увеличивающий протонную проводимость мембран. По своей
постановке эксперименты по измерению потенциала с помощью ФКФ и с помощью
валиномицина одинаковы с той лишь разницей, что теперь добавлением
кислоты или основания варьируют pH среды, а не концентрацию К+ (рис.
