Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
3.7. Лиганды, меченные изетепами иеда
Введение внешней метки в молекулу лиганда используется обычно при работе с крупными пептидами и белками, но в последнее время этот метод все чаще применяют и при работе с гаптенами, такими, как стероиды и лекарственные препараты, поскольку при таком способе маркирования можно получать соединения с высокой удельной радиоактивностью (например, в случае иодированных стероидов удельная радиоактивность может достигать 2000—4000 Ки/ммоль против 25— 100 Ки/ммоль в случае стероидов, содержащих в качестве внутренней метки тритий). Несмотря на то что в литературе были описаны и другие метки (см. ниже), в настоящее время почти во всех работах в качестве метки используются изотопы иода, в связи с чем вопросы, связанные с применением этих изотопов, будут рассмотрены более детально. Общие методы модификации боковых цепей белковых молекул описаны Глейзером и др. в томе 4 настоящей серии." Меры предосторожности, которые необходимо принимать при работе с изотопами иода, Описаны в Приложении V.
3.7.1. Метеды иодировании
Атомы водорода ароматических колец тирозиновых остатков боковых цепей белковой молекулы могут сравнительно легко замещаться на атомы иода (рис. 3.3) с образованием стабильного соединения; если иод находится в форме радиоактивного изотопа (1251 или 1311), то такое соединение представляет собой высокоэффективную метку. Атомы иода могут замещать атомы водорода также и в других аминокислотах, в том числе в гистидине, хотя скорость реакции в этом случае будет в 30—80 раз меньше, чем в случае тирозина. Степень замещения и место локализации атомов иода в тирозине могут быть разными в зависимости от количества используемого иода и от природы пептида. При низкой концентрации иода
?ю/гавая цепь тирозина ОН
ОН
Рве. 3.3. Замещение атомов водорода ароматических колец тирозина в боковой цепи белковой молекулы атомами изотопа ‘*4 в присутствии окислителя (хлорамина Т).
в реакционной смеси (1 атом иода на молекулу или меньше) в основном будут происходить единичные замещения, т. е. будет образовываться моноиодтирозин, и только при значительно более высоком содержании иода будет образовываться ди-иодтирозин; образования дииодтирозина следует избегать, поскольку оно приводит к уменьшению стабильности. Разные тирозиновые остатки одной и той же молекулы пептида или белка могут значительно различаться по своей реакционной способности; так, например, иисулин содержит всего 4 остатка- тирозина — два в 14-м и 19-м положениях A-цепи и два в 16-м и 26-м положениях В-цепи; большая часть иода попадает при замещении в 14-е положение A-цепи, некоторое количество— в 19-е положение A-цепи и весьма незначительное количество в 16-е и 26-е положения В-цепи (Freedlender, Cathou, 1971).
Описано много различных способов иодирования. Общим во всех способах является превращение .отрицательного иона иода (I-), обладающего относительно слабой реакционной способностью, в более реакционноспособные формы, такие, как свободный иод (Ь) или положительно заряженные ионы иода (I+). Механизм такого превращения еще не очень ясен, литература противоречива, и этот вопрос здесь обсуждаться ие будет.
Ниже перечислены известные в настоящее время способы иодирования; основные различия между ними состоят в использовании разных агентов для превращения иодида в более реакционноспособную форму; широкое распространение получил только первый из перечисленных способов, основанный на ' применении хлорамина Т,
1) Хлорамин Т (Greenwood et al., 1963), первоначально поступивший в продажу в качестве дезинфицирующего средства, является сильным окислителем, способным превращать иодид в более реакционноспособную форму. Методика получения меченого пептида проста. Она сводится к смешению растворов пептида, иодистого натрия (содержащего 1251 или ш1) и хлорамина Т; реакцию иодирования останавливают добавлением восстановителя — метабисульфита натрия. Простота этого способа иодирования объясняет его почти универсальное применение, и именно эта простота, как уже отмечалось, во многом способствовала широкому распространению радиоиммунологического метода анализа. Практические аспекты этого способа описаны в разд. 3.7.2.
2) Хлористый иод (McFarlane, 1958); раствор хлористого иода (ICI) смешивают с растворами изотопа и пептида.
3) Хлор и гипохлорит (Redshaw, Lynch, 1974).
4) Лактопероксидаза (Marchalonis, 1969; Thorell, Johansson, 1971). Преимущество ферментативного способа иодирования в присутствии следов перекиси водорода заключается в том, что пептид при этом не подвергается действию слишком высоких концентраций окислителя, такого, как хлорамин Т. Кроме того, для прекращения реакции нет необходимости добавлять восстановитель, поскольку реакцию можно остановить путем простого разбавления раствора. Лактопероксидаза может быть также иммобилизована на твердом носителе и удалена в случае необходимости центрифугированием (Каго-nen et al., 1976). Согласно имеющимся данным, меченые лиганды, приготовленные описанным способом, не так сильно «повреждаются» по сравнению с мечеными лигандами, полученными путем иодирования в присутствии хлорамина Т (Thorell, Johansson, 1971; Karonen et al., 1975), в связи с чем этот метод часто используют в тех случаях, когда требуется минимально поврежденный меченый лиганд. Однако попыток строгого сравнения лактопероксидазного способа иодирования с тем, в котором используются небольшие количества хлорамина Т, сделано не было. Недостаток лактопероксидазного способа заключается в том, что приготовление реагентов и условия проведения реакции являются более сложными в техническом отношении, чем в методе, основанном на применении хлорамина Т.
