Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 30

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 100 >> Следующая

5) Ионообменная хроматография. При использовании подходящих градиентов этот довольно сложный метод в принципе может обеспечить хорошее разделение слабо различающихся молекул пептида, в том числе поврежденных и неповрежденных молекул. Тем не менее для очистки меченых пептидов его используют редко, поскольку он трудоемок и очистка с его помощью занимает много времени.
6) Хроматографирование методом гель-фильтрации. Для очистки иодированных меток метод гель-фильтрации используется наиболее широко. В этом случае применяется обычная техника гель-фильтрации (см. Fischer, 1971), но при этом особенно большое значение имеет скорость. Поскольку меченый пептид нужно приготовить и охарактеризовать в пределах одного рабочего дня, приходится использовать высокую скорость фильтрации, которая, возможно, не является оптимальной, но с практической точки зрения дает вполне удовлетворительное разделение. Возможности методики иллюстрирует рио. 3.10, на котором в качестве примера показано фракцио-
Рве. 3.10. Хроматографирование иодированного плацентарного лактогена человека на колонке диаметром 4 см и высотой 60 см. заполненной сефадексом G-75, с элюцней 60 мМ вероналовым буфером, содержащим 0,5 мг/мл человеческой сыворотки. Первый пик содержит иодированный белок, а второй—свободный нодид. Белковый пик асимметричен, что связано, вероятно, с присутствием в первой половине пика агрегированного материала. Фракции этой части пика обладают значительно меньшей иммунологической активностью, чем те, которые выходят позже. На оси ординат—число импулъсов
в секундухЮ3.
нирование иодированного плацентарного лактогена человека на колонке с сефадексом G-75. Отчетливо видны два пика, первый из которых содержит меченый белок, а второй — свободный иодид. Первый пик не является гомогенным: во фракциях, выходящих с колонки раньше, процент меченого белка, способного связываться с антителами, меньше, чем во фракциях, выходящих позднее. Можно предположить, что в ранних фракциях содержится поврежденная метка, скорее всего,
‘Ррапция (Sjtjt)
Рве. 3.11. Хроматографирование иодированного плацентарного лактогена человека на колонке диаметром 1 см и высотой 40 см» заполненной сефадексом G-75» с элюцней 60 м/А вероиаловым буфером» содержащим 0,5 мг/мл сывороточного альбумина чело* века. Первые три пика содержат белок» а четвертый—свободный нодид. Из трех бел» ковых пиков только третий пнк обнаруживает значительную реакцию со специфично рдем антителом к пролактину.
более высокомолекулярные полимеры. Отбор фракций, обладающих наибольшей иммунореактивностью, позволяет получить эффективный меченый белок, который можно использовать при анализе. Еще более демонстративный пример приведен на рис. 3.11. При фракционировании после иодирования относительно грязного препарата человеческого пролактина получают три четких пика иодированного белка, из которых только один сохраняет способность достаточно активно реагировать с антителами.
В табл. 3.4 описан способ проверки меченого лиганда после его очистки методом гель-фильтрации.
Таблица 3.4
Проверка-иодированного белка, предназначенного для радиоиммунологического анализа
1. Отбирают аликвоты из каждой фракции (5—10 мкл) белкового пика, полученного при гель-фильтрации на колонке с сефадексом (рис. 3.10— 3.12)
2. Разбавляют каждую аликвоту буферным раствором, содержащим
2 мг/мл БСА, с таким расчетом, чтобы 0,2 мл полученного раствора давали приблизительно 10 000 импульсов за 10 с
- 3. Инкубируют каждую аликвоту с избытком антисыворотки нли без та-коного в тех же условиях, в которых определяют величину нулевого стандарта и холостой пробы (см. табл. 1.3 и рис. 1.7)
4. Объединяют фракции, содержащие материал, обладающий наибольшей иммунной активностью. Контролируют аликвоту объединенной фракции по калибровочной кривой
Записывают следующие данные:
1. Строят график, характеризующий распределение радиоактивности (число импульсов по фракциям, полученным при гель-фнльтрацнн на сефадексе)
2. Откладывают иа этом же графике процент связывания меченого лиганда каждой фракции в присутствии избытка антител
3. Исходя из данных кривой элюцнн, рассчитывают выход в процентах (отношение общего числа импульсов в белковом пике к общему числу импульсов в элюате X Ю0)
4. Рассчитывают концентрацию меченого лигаида в объединенных фракциях (общее количество лиганда, взятого для иодирования, делят на объем белковых фракций; в тех случаях, когда отбрасывается значительное количество белка, следует вносить соответствующую поправку)
В основном тексте рассматриваются дополнительные методы контроля.
Их главная цель — тщательная проверка меченого лиганда в процессе
анализа.
7) Тонкослойная хроматография. Метод тонкослойной хроматографии широко используется для очистки меченых лигандов низкого молекулярного веса, таких, как стероиды и некоторые лекарственные препараты (Stahl, 1969). Хотя этот метод в принципе мог бы быть использован также для очистки иодированных пептидов, тем не менее он никогда не применялся для этой цели.
Предыдущая << 1 .. 24 25 26 27 28 29 < 30 > 31 32 33 34 35 36 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed