Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
2) Концентрация реагентов. Для быстрого и эффективного иодирования концентрация всех реагентов в реакционной смеси должна быть по возможности большой. Это условие предполагает использование минимальных объемов, поскольку абсолютные количества реагирующих веществ определяются другими факторами; общий начальный объем реакционной смеси, включающей изотоп, пептид, хлорамин Т, не должен, как правило, превышать 100 мкл.
3) Количество хлорамина Т. Поскольку хлорамин Т способен вызывать повреждения иодируемого пептида, его следует использовать в минимальных количествах. Хотя обычно хлорамин Т добавляют в количестве 50 мкг, часто оказывается, что 10 мкг и даже 2 мкг дают такой же эффект, а получаемый при этом продукт оказывается менее поврежденным и более стабильным при хранении. Минимальное допустимое количество хлорамина Т можно установить только путем проб и ошибок.
4) pH реагентов. Оптимальное значение pH при иодировании тирозиновых остатков равио 7,5; при pH больше 8,0 может происходить замещение по другим группам, а при pH больше 9,0 эффективность реакции резко снижается. Изотопы иода обычно поставляются в виде растворов в 0,1 н. NaOH, в связи с чем среда, в которой добавляют другие реагенты, должна быть такой, чтобы реакционная смесь могла быть забуферена до pH 7,5.
5) Перемешивание реагентов. Одной из наиболее распространенных ошибок, приводящих к низкому выходу, является неправильное перемешивание реагентов. Особенно часто это имеет место при использовании маленьких объемов; в этом случае небольшая капелька на стенке пробирки, если ее не стряхнуть обратно в реакционную смесь, может составить половину, а то и большую часть одного из реагентов.
6) Скорость перемешивания. При концентрациях, приведенных в табл. 3.3, реакция иодирования протекает фактически мгновенно, в связи с чем перемешивание должно продолжаться лишь столько времени, чтобы быть уверенным, что оно действительно произошло. Весь процесс, начиная с момента добавления исходных реагентов до остановки реакции, должен занимать не более 20—30 с.
7) Температура реакции. Некоторые исследователи предпочитают использовать при иодировании реагенты, охлажденные льдом. До сих пор, однако, никем не доказано преимущество такого способа по сравнению с проведением реакции при комнатной температуре.
8) Качество изотопа. Уже вошло в привычку относить плохие результаты иодирования за счет плохого качества изотопа. Несомненно, в тот период, когда изотопы иода впервые стали доступными для широкого использования, одни партии могли значительно отличаться от других. Однако в последние годы положение изменилось к лучшему до такой степени, что плохие результаты иодирования уже нельзя отнести за счет качества самого изотопа, и почти во всех такого рода случаях причина кроется в одной или нескольких технических ошибках, допущенных прн проведении иодирования.
3.7.3. Повреждения лиганда, вызываемые иодированием
Термин «повреждение» мы будем использовать в дальнейшем изложении лишь в том смысле, что какая-то часть меченого лиганда утрачивает в процессе обработки способность реагировать со связывающим агентом. Это чисто практическое, рабочее понятие, при котором не принимаются во внимание никакие физико-химические изменения лиганда, если они не отражаются на его поведении в процессе анализа. Если принять такое определение термина «повреждение», то можно указать на несколько причин возможного повреждения лиганда.
1) Изменения молекулы, связанные с введением в нее одного или нескольких атомов иода. В принципе можно было ожидать, что введение атомов иода будет оказывать более сильное влияние на реакционную способность в случае небольших молекул, чем в случае больших молекул. Это предположение оказалось правильным и было подтверждено на при* мере эстрогенов, иодирование которых по фенольному кольцу А приводит к потере их способности реагировать со специфической антисывороткой. В других случаях введение метки может приводить к изменению только части молекулы и тем не менее может вызывать изменение специфичности системы. Такая возможность схематически показана на рис. 3.7, на котором изображена следующая гипотетическая ситуация. Проводится радиоиммунологический анализ окситоцина. Антисыворотка содержит две популяции антител, одна из которых специфична к С-коицу, а другая — к N-концу молекулы. Введение иода в остаток тирозина блокирует реакцию с антителами, специфичными к С-концу, но не влияет на реакцию с антителами, специфичными к N-концу. Если обе популяции антител обладают одинаковым сродством, то чувствительность системы практически не изменится. Специфичность по отношению к интактной молекуле также не должна измениться. Вместе с тем при проведении анализа в этой системе наряду с интакт-
Антитело к С-концу Антитело к N-/гонцу
А А
^ '251
Су5 - Туг-//е - Gin- Asп- Cys-Pro-Lev-GIu (N!i2)
I—,-,-i
Рис. 3.7. Схематическое изображение механизма» посредством которого введение иода в молекулу может влиять на специфичность определения (в данном случае ионапеп-тида окситоцина) при использовании антисыворотки» содержащей две популяции антител—к N- и С-коицу молекулы соответственно. Если введение иода в тирозин полностью изменяет аитнгенность С-конца молекулы пептида, тогда эффективностью при определении будут обладать только антитела к N-коипу. В результате при такой ситуации будут измеряться только ннтактные молекулы и N-коицевые фрагменты а ие будут учитываться поврежденные С-концевые фрагменты.
