Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 29

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 100 >> Следующая

6) Повреждение, связанное с загрязнением. Так называемый «чистый антиген», используемый для иодирования, может быть загрязнен посторонними веществами; очевидно, что такде загрязнение антигена следует рассматривать как его повреждение, поскольку примеси захватывают часть метки, но не реагируют со связывающим агентом. Во многих случаях такие загрязнения удается обнаружить уже при физико-химическом анализе «чистого» антигена. Однако результаты таких анализов могут ввести в заблуждение, если методы, применяемые для обнаружения загрязнений (например, спектрофотометрический метод), обладают значительно меньшей чувствительностью, чем метод радиоактивных изотопов. Такая ситуация схематически показана на рис. 3.9, где кажущееся различие в расположении хроматографических пятен, соответствующих меченому и немеченому лигандам, целиком связано с чувствительностью метода их обнаружения. В то же время
Аграмя/паграф?/р0&{г//1/и
Рнс. 8.9. Пример ситуации, когда при исследовании недостаточно чувствительным методом (спектрофотометрня) белок ка* жется гомогенным, а после иодирования при анализе более чувствительным методом (радиометрия) оказывается, что он состоит из нескольких компонентов. Дополнительные пики можно было бы отнести за счет повреждения, тогда как на самом деле они присутствовали в исходном препарате. Пунктирной линией / обозначен предел чувствительности при спектрофотометрнн, линией //—предел чувствительности при счете числа импульсов.
добавочные пики, обнаруживаемые по радиоактивности, легко можно было бы принять за молекулы лиганда, изменившиеся в процессе введения метки.
3.7.4. Очистка иодированного лиганда
После завершения процесса иодирования реакционная смесь содержит следующие компоненты: немеченый лиганд (поврежденный и неповрежденный), меченый лиганд (поврежденный и неповрежденный), свободный иодид и соли, включая окислители и восстановители. Используемый для анализа меченый лиганд должен содержать не менее 95% неповрежденных молекул, а так как доля меченых молекул в реакционной смеси обычно намного меньше, приходится почти во всех случаях проводить очистку.
Для очистки иодированного лиганда могут быть использованы практически все физико-химические методы, которые применяются в химии белков и пептидов. Критерии, предъявляемые к методу очистки, — эффективность, простота и быстрота. Последнее условие особенно важно в связи с относительно малой стабильностью иодированного лиганда при низких его концентрациях, тогда как при очистке больших количеств немеченого лиганда это условие не является столь уж важным. Ниже будут коротко охарактеризованы все существующие в настоящее время способы очистки; следует подчеркнуть, что широкое применение получил только один метод, а именно метод гель-фильтрации.
1) Разбавление. При иодировании принято после окончания первичных реакций как можно быстрее разбавлять реакционную смесь. Добавляемый объем будет зависеть от того, какой этап очистки следует за иодированием, и может колебаться от 0,5 мл (если вслед за иодированием проводится гель-фильтрация) до 25 мл (если очистку проводят путем добавления адсорбентов). Разбавление само по себе нельзя, конечно, считать очисткой, однако эта операция является необходимым этапом, предшествующим очистке. Во-первых, она позволяет получить достаточно большой объем, который облегчает работу на последующих этапах. Во-вторых, при разбавлении уменьшается возможность повреждения, связанного с внутренним облучением или с присутствием высоких концентраций химических агентов. И в-третьих, разбавитель обычно содержит белок, например альбумин, который служит в качестве носителя и повышает стабильность многих белков в сильно разбавленных растворах.
2) Химическое осаждение. Этот способ может, например, применяться для отделения иодированного IgG от иодида путем осаждения первого половинным объемом насыщенного
раствора сульфата аммония. На практике операцию осаждения почти никогда не проводят, поскольку оно легко может приводить к получению поврежденных продуктов.
3) Диализ. В принципе диализ вполне можно было бы использовать для отделения большинства пептидов от иодида, но этот метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую ценность. К этим недостаткам относятся необходимость относительно большого времени для диализа, поглощение многих пептидов диализными мембранами, а также то обстоятельство, что поврежденные меченые пептиды в процессе диализа трудно отделяются от неповрежденных.
4) Адсорбция. В простейшем виде этот способ сводится к добавлению в пробирку с реакционной смесью ионообменной смолы, которая адсорбирует на себе свободный иодид и другие соли. Метод годится только для небольших синтетических пептидных гормонов, не претерпевающих обычно значительных повреждений-. В случае более крупных пептидов, таких, например, как АКТГ и гонадотропины, широко используются мелкозернистые адсорбенты типа целлюлозы, которые либо непосредственно добавляют в пробирку, либо применяют в виде небольших колонок. Процесс очистки при использовании метода адсорбции, судя по всему, довольно сложен, и его механизм не совсем ясен. Тем не менее во многих случаях этот метод позволяет быстро и эффективно отделить неповрежденную метку от других компонентов. Его недостаток заключается в том, что эффективность очистки может меняться от одной партии целлюлозы к другой, и оптимальные условия разделения для каждой данной партии приходится устанавливать отдельно путем проб и ошибок.
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed