Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
5) Электролиз (Rosa et al., 1964). При пропускании через реакционную смесь электрического тока иодид превращается в реакционноспособную форму.
6) Получение паров иода; смесь хлорамина Т и иодистого натрия, содержащего радиоактивный изотоп иода, дает газообразный иод. Реакцию проводят в герметичном сосуде, внутри которого помещен сосуд меньшего диаметра, содержащий
раствор пептида; образующиеся в большом сосуде пары газообразного радиоактивного иода диффундируют во внутренний сосуд. Описана модификация этого метода (Butt, 1972), при которой в наружном сосуде смешивают хлорамин Т и NaCl, а во внутреннем сосуде — раствор пептида и иодистый калий, содержащий радиоактивный изотоп иода. Пары хлора диффундируют во внутренний сосуд и вызывают образование свободного радиоактивного иода, который иодирует пептид. Оба метода дают более низкий выход (если оценивать его по проценту включения изотопа в пептид) по сравнению с обычными методами, но получаемый меченый пептид обладает, по заявлению авторов, более высоким качеством благодаря щадящим условиям реакции.
7) Опосредованное введение метки (метод конъюгации) (Bolton, Hunter, 1973). В этом методе иод вначале связывают с промежуточным носителем, содержащим фенольную или имидазольную группу, по которой происходит иодирование, а также аминогруппу для связывания с лигандом или его производным (рис. 3.4, 3.5 и табл. 3.2). Метод обладает рядом преимуществ: во-первых, иодируемый пептид не подвергается химическому повреждению, которое часто имеет место при обычном иодировании; во-вторых, метод может быть применен для иодирования пептидов, не содержащих тирозиновых остатков; в-третьих, конечная реакция, которая протекает при простом перемешивании пептида и иодированного сложного эфира, очень проста и может быть с успехом использована для иодирования соединений, которые нельзя иодировать прямым птуем (например, таких, как стероидные гормоны).
Таблица 3.2
Общий метод опосредованного введения внешней метки в белки
(Bolton, Hunter, 1973 '))
1. Открывают ампулу, содержащую 1 мКи N-сукциннмндил-З- (4-окси,5-[1251] иодофенил)пропионата (Radiochemical Centre, кат. № IM861), н
выпаривают растворитель, направляя на поверхность слабую струю азота
2. Добавляют в ампулу белок (5 мкг), растворенный в 0,01 мл 0,1 М бо-ратного буфера, pH 8,5, и перемешивают смесь в течение 15 мин при 0°С
3. Добавляют в ампулу 0,5 мл 0,2 М глицина в 0,1 М боратном буфере, pH 8,5. Выдерживают смесь в течение 5 мии при 0° (глицин реагирует с исходным сложным эфиром и препятствует его связыванию с белком-носителем)
4. Реакционную смесь пропускают через колонку с сефадексом G-50 нли G-75 и подвергают полученный меченый белок проверке (см. табл. 3.3—3.5, а также рис. 3.10—3.12.)
1) Метод был первоначально описан для плацентарного лактогена человека» но, по всей вероятности» он может быть использован для всех белков.
но
и '
CHo-C-NHo
^ Ме/т/лавыи згрир /тш/гйи/мя
Тирамин
U—СНо-NHo
* * Гистамш
%
Рис. S.4. Иодированные соединения, которые могут быть использованы для непрямого введения изотопа '“I в молекулу лиганда.
ОН
сн,
Ha-C-C-0-N : о
,с-сна I
* с-снх
I
Эсрнр Л'- 0км/сг//гщ/ним{/да
и J’ (/7-о/гси<ренмл) -/7р0/7#0Н000й fU/C/70/77d>/
он
W, IW,
I
V > с* о
СН, Н NH
1 1 I
Hj-C-C-N-ICH,),- СН
о i-o
I
NH
”5nT * Хлорамин^
он
"I
сн,
На- С - С - О - N ^
I N
о
о
с-сн,
с - сн,
I
о
flaffi/pQ&affHwif spttp +
1
Ом о Ан
I
NHj-(CHj),- СН
Реакция
'ттюмкии
1
СоО
I
NH
I
«-аминогруппа лизина i/jru N-/гонец uoffi/pi/елгаеа Рема
Рис, 3.5, Схема введения метки методом конъюгации по Болтону и Хантеру (Bolton
Hunter, 1973).
Сбязшахпций
yvac/no/c
