Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
7.2. Систеыы переноса заряда
В 1969 г. была предложена Г*1 ЗР73 весьма плодотворная идея, объясняющая аномально высокую реакционную способность серинового гидроксила в химотрипси-не. Кристаллографические данные, а также более тщательное исследование первичной структуры фермента показали, что три функциональных группы - Asp102 (которая раньше считалась остатком Asn), His57 и Ser195 - сближены в пространственной структуре фермента и образуют единую систему, связанную водородными связями:
Поскольку карбоксильная группа Asp102 находится в гидрофобном окружении и экранирована от растворителя, было высказано предположение, что ее рКа является аномально высоким, и поэтому система связей может изомеризоваться:
Аналогичная система была постулирована [1231,1240,3063,3172] для многих других сериновых протеаз. В такой системе заряд с карбоксильной группы может быть перенесен в нейтралы ой среде на сериновый гилроксил, и последний приобретает весьма высокую нуклеофильность.
В качестве аргумента в пользу наличия такой системы в сериновых протеазах рассматравались [3145] данные о том, что ее разрушение путем метилирования Яег-атома His57 в химотрипсине снижает каталитическую активность более чем на пять порядков [1325]. Надо, однако, отметить, что, несмотря на очень небольшие изменения в активном центре, Нis57-метилхимотрипсин по многим параметрам сличается от нативного фермента [3173], в том числе, например, по устойчивости к денатурации [3174]. Таким образом, причина низкой каталитической активности этого производного может быть не связана с разрушением "системы переноса заряда". Более того, в неактивных химотрипсиногене и щелочной форме химотрипсина положение групп, образующих эту систему, такое же, как в нативном ферменте [2290].
Необходимыми условиями переноса заряда должны быть близость значений рК имидазола и Asp102 и расположение всех атомов, участвующих в образовании системы, оптимальным образом для возникновения прочных водородных связей.
Предпринималось много попыток определить истинные значения рКа групп, входящих в систему переноса заряда с использованием разностного титрования
БеП 95
Sen 95
в условиях денатурации фермента [31751, ИК- [23551 и ЯМР-титрования [2349, 2350,3157,3158,31761. Исследования дали противоречивые результаты. Утверждалось [2355,3176], что эти данные согласуются с наличием системы переноса заряда и что группа фермента, ионизирующаяся при рН«*7, принадлежит остатку Asp102, a His57 не протонируется вплоть до pH 2.
Это привело к формулированию другой схемы, включающей "систему переноса заряда", функционирующую в процессе катализа [3176]:
Эта схема предусматривает согласованный перенос двух протонов на скорость лимитирующей стадии, что не противоречило данным 13177] по "инвентаризации протонов" (измерение зависимости кинетического изотопного эффекта растворителя в смесях H20/D?0 разного состава; см. разд.3.3.3), указывающих на "мультипротонный" катализ [3178]. Однако этот катализ наблюдался и для (Ne2-Me тилгистидин)-химотрипсина, у которого система переноса заряда отсутствует [3179].
В дальнейшем [2350,3180,3181] на примере а-литической протеазы (содержащей только один гистидин) было показано, что рК His57 около 7. С этим согласуются результаты [2349,31571 исследования низкопольных сигналов ЯМР химотрипсина и других сериновых протеаз, а также результаты [3158] С2-протон-ного резонанса имидазола в трипсине. Анализ структуры протеазы А из Strep-tcmyces grtseus показал [3063], что карбоксильная группа Asp102 связана максимально возможным числом Н-связей (4 связи) и поэтому не может иметь высокого значения рК&.
Кристаллографические данные подвергались неоднократному пересмотру. Ревизия исходных данных [1327] показала [1249], что в нативном а-химотрипси-не, а также в 7-химотрипсине, трипсине, субтализине BPN' и эластазе серино-вый гидроксил не лежит в плоскости имидазольного кольца и 07-атом Sen 95
, о о
отстоит от N -атома His57 на 3,5-3,7 А и отклоняется на 2,5-3,5 А от расположения, необходимого для образования водородной связи (рис.106). Хотя в
сериновых протеазах остаток Ser195 может достаточно свободно вращаться вокруг Са-Ср-связи примерно на 120° (см. разд.6.5.3), ни в одном из его положений он не приближается к Ne2-aT0My His57 настолько, чтобы образовать хорошую водородную связь [1229]-
Волее поздние результаты показали, однако, что в химотрипсине [1226],
Sen 95
R'-HNC-R
i
Seri 95
Рис.106. Стереопара расположения остатков Seri95, His57 и Asp102 в активном центре бычьего а-жимотрипсина [1249]
трипсине [1243], калликреине [1243] и протеазе A Streptornyces grlseus
о
[3063] это расстояние составляет 2,7-2,9 А.
Наконец, с помощью нейтронографического анализа трипсина и его комплекса с ингибитором, имитирующим тетраэдрическое промежуточное соединение, были получены [3182] прямые доказательства отсутствия переноса протона на Asp102, однако водородная связь между Ser195 и HIs57, по-видимому, существует [3183,3184].
